重组人核糖核酸酶抑制因子对小鼠脑缺血的抗氧化保护作用及其抗肿瘤的研究

论文摘要

背景介绍:核糖核酸酶抑制因子[1]（Ribonuclease Inhibitor, RI）是分布在胞浆内酸性糖蛋白,分子量约为50KDa[2],其基因位于染色体11p15.5,三级结构呈对称的马蹄型。RI包含15个亮氨酸重复序列（Leucine-rich repeat, LRP）[3],而且每个RI分子中含有32个高度保守的半胱氨酸残基,其中至少30个半胱氨酸的巯基以还原型巯基的形式存在,还原型巯基是保持RI正常生物学活性所必需的,这也决定了RI只有在还原性的环境中才能发挥其作用。RI是核糖核酸酶A（Ribonuclease A, RNase A）的抑制剂,可以有效地抑制其对RNA的水解作用。RNaseA与血管生成因子（Angiogenin,Ang）的氨基酸有着高度保守的同源顺序。Ang是由肿瘤细胞和正常细胞分泌的分子量为14.4kDa的蛋白质,属于RNaseA超家族的一员,在组织和细胞中的分布十分广泛。血管生成因子在体内和体外均具有强烈的诱发血管生成的活性。RI通过与RNaseA（ki=4.0×10-14M）的紧密结合而抑制他们的活性[4]。根据cDNA序列分析,Ang与RNase A有35%的同源性;但Ang与RI有更大的亲和力（ki=7.1×10-16M）。X射线分析表明,Ang与RNase A有着极其相似的立体结构,二者都可以与人胎盘RI紧密结合。由于RI可以与Ang形成紧密的非共价结合,从而可以抑制其促血管生成的活性。此外RI还可能通过抑制碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）的表达等途径抑制血管生成。目的:1.通过脑缺血再灌注损伤模型的建立,观察RI对实验动物脑缺血再灌注损伤的影响。2.通过RI对黑色素瘤小鼠的肿瘤抑制作用来进一步阐明RI对抑制肿瘤的生长方面的影响。方法:1.重组的pGEX-6p-1-hri大肠杆菌中表达和纯化将重组的pGEX-6p-1-hri转化到大肠杆菌Rosetta表达菌中,在0.5mmol的诱导剂IPTG和16℃的温度条件下来诱导表达目的融合蛋白,收集大量培养的菌体,经超声破碎,收集离心后的上清,经由GST亲和层析柱分离纯化,及20%聚乙二醇8000浓缩。2.RI对小鼠脑缺血再灌注的影响将纯化后的GST-RI腹腔注射到小鼠体内,预先保护3天后,手术分离出颈总动脉,结扎、制作脑缺血损伤模型[6]。组别为:假手术组,模型组,GST-RI低剂量治疗组,GST-RI中剂量治疗组,GST-RI高剂量治疗组,GST治疗组,术后缺血再灌注30min后,第2次给药（同术前）,小鼠脑缺血24h后断头处死,检测SOD、MDA、GSH-Px指标,并在光镜下观察海马区神经细胞的损伤程度。3.RI对黑色素瘤小鼠的肿瘤抑制将小鼠黑色素瘤细胞B16接种在小鼠皮下,分别以生理盐水为阴性对照,以环磷酰胺为阳性对照,高低剂量的融合蛋白进行治疗。观察GST-RI是否可以抑制肿瘤的生长。结果:融合蛋白GST-RI能显著降低脑缺血小鼠皮质及海马组织中MDA的含量,能显著提高脑缺血小鼠脑皮质及海马组织中SOD、GSH-PX的活力。皮下注射GST-RI,对小鼠黑色素瘤的抑制作用与剂量有线性关系。当剂量为5000U（0.52mg/kg）时抑制率最高可达34.62%,当剂量增加到10000U（1.04mg/kg）时抑制率最高可达46.33%,平均抑瘤率为40.50%。说明GST-RI可以通过抑制肿瘤血管生成的途径抑制肿瘤的生长,瘤重减轻。结论:融合蛋白GST-RI对脑缺血小鼠脑组织有很强的抗氧化作用,对脑缺血再灌注损伤有保护作用。该融合蛋白GST-RI可以有效抑制皮下种植的小鼠黑色素瘤B16瘤内的血管生成,通过抑制肿瘤血管的新生,从而抑制了肿瘤的生长和转移。进一步证实了RI在氧化应激相关性疾病和肿瘤相关疾病中的治疗作用,并为RI的临床应用提供了有价值的实验依据和线索。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 第一部分
• （五） 第二部分
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢