论文摘要
研究背景淋巴瘤是原发于淋巴造血组织的恶性肿瘤,随着人类生存环境的不断恶化及人们生活工作压力的不断上升,近年来淋巴瘤的发病率逐年升高。miRNAs（miRNAs）是一类普遍存在于动植物中的长度约为22个核苷酸的内源性非编码小分子RNA,迄今为止,大约有2000多种miRNA被发现鉴定,它们参与细胞增殖、分化、凋亡、和胚胎发育等一系列重要的生命过程。最近研究还发现miRNA与肿瘤的发生也有着密切的关系,大量的miRNA都位于染色体基因组的不稳定区域,而这些区域在肿瘤细胞中经常发生缺失或突变,因此导致许多miRNA在肿瘤组织中表达下调,但也有少数的miRNA表达上调,说明许多miRNA具有类似抑癌基因和癌基因的功能。越来越多的证据表明肿瘤的发生是由于正常细胞分化紊乱或分化阻滞的结果。而肿瘤细胞分化紊乱是一个多基因,多步骤的过程,单独改变某种基因的表达很难对细胞分化产生明显影响。但是miRNA不同,一种miRNA可以调控数百种靶基因,而且它所调控的基因中相当一部分是转录因子,转录因子本身就扮演一个调控者的角色,因此改变一种miRNA的表达就可以对细胞的分化产生剧烈的效应。诱导分化治疗是未来肿瘤治疗的一个新的发展方向,所谓诱导分化治疗又称为肿瘤细胞的再分化（redifferentiation）,是指在某些诱导分化剂的作用下,通过改变肿瘤细胞的增殖、浸润、侵袭、转移等恶性特征,诱导肿瘤细胞向正常细胞方向分化,达到治疗肿瘤的目的。miRNAs具有强烈的调控细胞分化的作用,调整其表达很有可能诱导肿瘤细胞向正常细胞分化,使miRNAs成为新型诱导分化剂。淋巴造血系统肿瘤是研究诱导分化的非常好的模式肿瘤,特别是B细胞淋巴瘤。因为目前国内外对B细胞的分化成熟过程研究的比较深入、透彻,B细胞的不同分化阶段都可以产生相应的淋巴瘤类型,并且不同分化阶段的B细胞都有其相应的免疫表型,为我们研究microRNA诱导肿瘤细胞分化提供了一个非常好的研究平台。hsa-miR-150基因位于19q13.33,成熟的hsa-miR-150由22个核酸组成。hsa-miR-150在淋巴造血组织中特异性高表达,而在其它组织和器官中表达较低。并且随着B细胞发育的不断成熟,其表达水平逐步升高,而其靶基因c-myb的表达模式与其恰恰相反。既然hsa-miR-150的正常表达对B细胞的分化至关重要,那么在成熟B细胞起源的淋巴瘤中hsa-miR-150的表达模式又是如何?如果我们纠正hsa-miR-150的紊乱表达能否诱导肿瘤细胞向正常B细胞方向分化?这是本课题所要解决的核心问题。目的1.探寻hsa-miR-150和c-myb在正常B淋巴细胞和淋巴瘤细胞系表达差异。2.构建稳定表达hsa-miR-150细胞亚系OCI-Ly10-miR-150和Raji-miR-150。3.探究miR-150诱导B淋巴瘤细胞向末端B细胞方向分化的可能性及其机制。方法1. hsa-miR-150和c-myb在正常B淋巴细胞和淋巴瘤细胞的表达采用HE染色、免疫细胞化学、MTT对三株新引进的弥漫大B细胞淋巴瘤（Diffuse large B cell lymphoma, DLBCL）细胞进行了形态学、免疫表型的鉴定；运用real-time PCR和原位杂交技术定量和定位检测hsa-miR-150在正常B淋巴细胞和各株淋巴瘤细胞表达水平；利用western blotting和免疫荧光细胞化学在蛋白水平从定量和定位的角度检测了hsa-miR-150的靶基因c-myb的表达水平。2.B淋巴瘤细胞OCI-Ly10-miR-150和Raji-miR-150亚系构建及其生物学特性提取含目的基因的慢病毒表达质粒,将含有质粒的菌液送公司测序；通过blast比对分析证明载体上所连接的hsa-miR-150的DNA序列及侧翼序列与GenBank所公布的相应序列完全相符；将包膜质粒（pMD2.G）与包装结构质粒（psPAX2）、目的基因重组质粒（实验组和对照组）三种质粒,通过LipofectamineTM2000共同转染至包装细胞293FT中,荧光显微镜下见大量绿色荧光,证实有大量质粒转染入293FT细胞,收集病毒上清；将含有重组慢病毒质粒（实验组,对照组）的病毒上清分别转染Raji和OCI-Ly10细胞系,命名为OCI-Ly10-miR-150、Raji-miR-150。并对新构建的细胞亚系,通过流式细胞技术检测细胞周期、细胞凋亡,及MTT法检测hsa-miR-150的生物学功能。3. hsa-miR-150通过下调c-myb诱导B淋巴瘤细胞系向末端B细胞方向分化通过real-time PCR在mRNA水平检测OCI-Ly10和OCI-Ly10-miR-150、Raji和Raji-miR-150的B细胞分化相关基因Pax5、Bcl-6、IRF4、PRDM1和XBP-1的表达水平；运用real-time PCR和Western Blotting检测OCI-Ly10和Raji细胞转染了hsa-miR-150后（OCI-Ly10-miR-150, Raji-miR-150） c-myb在mRNA水平和蛋白水平。通过western blotting在蛋白水平检测了Raji-miR-150和OCI-Ly10-miR-150细胞Bcl-6和PRDM1的表达水平。4.统计学处理采用统计软件SPSS 13.0对实验结果进行统计学处理和分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示。MTT法检测细胞增殖能力采用析因设计资料的方差分析和单因素方差分析（One-Way ANOVA）,多重比较选用LSD法比较各组间差异。Real-time PCR检测has-miR-150的表达水平采用多个独立样本非参数检验和两个独立样本非参数检验。流式细胞仪检测凋亡指数和细胞周期采用两样本t检验。real-time PCR检测Pax5、Bcl-6、IRF4、PRDM1、XBP-1和c-myb的表达水平采用两个独立样本非参数检验。按α=0.05水平,P<0.05,差异具有统计学意义。结果1. hsa-miR-150和c-myb在正常B淋巴细胞和各株淋巴瘤细胞的表达（1）三株DLBCL细胞形态学、免疫表型及增殖能力OCI-Ly1由多量中心母和少量免疫母细胞组成,OCI-Ly8主要由中心母细胞组成,OCI-Ly10主要由免疫母细胞组成。分子亚型分析OCI-Ly1和OCI-Ly8属于A型,也就是生发中心性（germinal center B cell-like, GCB）, OCI-Ly10属于B型,也称活化B细胞性（activated B cell-like, ABC）或称为Non-GCB型。MTT法检测OCI-Ly1、OCI-Ly8、OCI-Ly10三组细胞体外增殖能力,经析因设计资料的方差分析结果显示不同细胞组之间差异具有显著性（F=34.321,P<0.001）。三组细胞经LSD法多重比较显示OCI-Ly10增殖能力显著高于OCI-Ly1和OCI-Ly8,差异具有显著性（P0.001）, OCI-Ly1与OCI-Ly8之间增殖能力无显著性差异（P=0.136）。（2） has-miR-150在正常B淋巴细胞及B淋巴瘤细胞表达Real-time PCR检测has-miR-150在正常B淋巴细胞及各株淋巴瘤细胞中表达,经多个独立样本非参数检验分析显示,不同细胞组间有显著性差异（χ2=22.797,P=0.002）；进一步采用两个独立样本非参数检验分析不同淋巴瘤细胞组与正常CD19+B cell的hsa-miR-150表达水平显示CD19+B cell的hsa-miR-150表达水平明显高于其它各组淋巴瘤细胞,差异均具有显著性（P≤0.05）。采用原位杂交技术检测淋巴瘤细胞株中has-miR-150的表达,结果显示在OCI-Ly1、OCI-Ly8、OCI-Ly10、Raji细胞系中has-miR-150的表达水平非常低,几乎不表达。（3） c-myb在各株淋巴瘤细胞表达水平通过western blotting在蛋白水平定量检测了c-myb （72KDa）的表达,在各淋巴瘤细胞株Karpas299、Jurkat、Raji和OCI-Ly10中表达水平较高；而在OCI-Ly1和OCI-Ly8中表达水平较低,特别是在L428中几乎不表达c-myb。通过免疫荧光细胞化学从定位的角度在共聚焦荧光显微镜下观察c-myb的表达,在Jurkat、Raji和OCI-Ly10中,c-myb的表达较强,而OCI-Ly8表达较弱。2. OCI-Ly10-miR-150和Raji-miR-150稳定细胞亚系的构建（1） pEZX-miR-150-eGFP重组慢病毒载体测序构建的pEZX-miR-150-eGFP重组慢病毒载体送invitrogen公司测序,经过DNA测序的结果表明,所获得的has-miR-150前体基因及其侧翼序列与GenBank所公布的相应序列相符,无碱基缺失及错误。并将测序结果输入Pubmed数据库,运用blast程序进行比对分析,与GenBank所公布的相应序列has-miR-150前体基因及其侧翼序列完全一致。（2）重组慢病毒载体包装将包膜质粒（pMD2.G）与包装结构质粒（psPAX2）、目的基因重组质粒（实验组和对照组）三种质粒,通过LipofectamineTM 2000共同转染至包装细胞293FT中,荧光显微镜下见大量绿色荧光,证实已有大量质粒转染入293FT细胞,通过光镜视野和荧光视野对比,感染效率在90%以上。（3）含有包装好质粒的病毒上清感染Raji和OCI-Ly10细胞将含有重组慢病毒质粒（实验组,对照组）的病毒上清分别转染Raji和OCI-Ly10细胞系。在荧光显微镜下可见大量绿色荧光,与光镜视野对比,大约有80-90%的细胞被感染重组慢病毒上清。经两个独立样本非参数检验分析显示转染后has-miR-150的表达水平明显高于转染前,差异均具有显著性（Wilcoxon W=6.000, P=0.037） has-miR-150在Raji和OCI-Ly10转染has-miR-150后,其表达水平分别上调了595倍和44倍。（4）MTT法检测Raji细胞has-miR-150转染前后的增殖能力MTT法检测Raji-control和Raji-miR-150增殖能力,经析因设计资料的方差分析结果显示Raji-control的增殖能力显著强于Raji-miR-150,差异具有显著性（F=171.451,P<0.001）。（5）流式细胞仪检测Raji细胞has-miR-150转染前后的细胞周期流式细胞仪检测Raji-control和Raji-miR-150细胞的细胞周期,计算各组细胞的增殖率（S期+G2期）%,经两样本t检验分析显示两组细胞的增殖率差异具有显著性（t=23.855, P=0.002）,Raji-control的增殖率明显高于Raji-miR-150。（6）流式细胞仪检测Raji细胞has-miR-150转染前后细胞凋亡流式细胞仪检测Raji-control和Raji-miR-150细胞的凋亡率,经两样本t检验分析显示两组细胞的凋亡率差异具有显著性（t=-18.651, P<0.001）, Raji-miR-150的凋亡率明显高于Raji-control。3. hsa-miR-150通过下调c-myb诱导B淋巴瘤细胞向末端B细胞方向分化（1）B淋巴瘤细胞hsa-miR-150转染前后末端B细胞分化相关免疫标记的表达经两个独立样本非参数检验显示Raji-miR-150和OCI-Ly10-miR-150细胞,B细胞分化相关基因的表达水平都发生了变化,Pax5和Bcl-6表达水平下调,且均具有显著性差异（Wilcoxon W=6.000, P=0.037）; IRF4、PRDM1和XBP-1的表达水平上调,也均具有显著性差异（Wilcoxon W=6.000, P=0.037）。（图3-1,表3-1；图3-2,表3-2）。（2）B淋巴瘤细胞hsa-miR-150转染前后c-myb的表达在OCI-Ly10和OCI-Ly10-miR-150中,经两个独立样本非参数检验分析显示,在mRNA水平,c-myb的表达水平在OCI-Ly10-miR-150中明显下调,差异具有显著性（Wilcoxon W=6.000, P=0.037）;在蛋白水平,从定量（western Blotting）和定位（共聚焦显微镜免疫荧光细胞化学）检测均证实在OCI-Ly10-miR-150中c-myb的表达水平明显下调。在Raji和Raji-miR-150细胞中,在mRNA水平,经两个独立样本非参数检验分析显示c-myb的表达水平明显下降,具有显著性差异（Wilcoxon W=6.000, P=0.037）;在蛋白水平,定量（western Blotting）和定位（共聚焦显微镜免疫荧光细胞化学）检测均证实在Raji-miR-150细胞中c-myb的表达水平明显下调。（3）B淋巴瘤细胞hsa-miR-150下调c-myb后Bcl-6和PRDM1蛋白的表达通过western blotting在蛋白水平检测了B细胞分化标记Bcl-6和PRDM1的表达水平。Raji-miR-150和OCI-Ly10-miR-150细胞Bcl-6的表达水平均显著下调。在Raji-miR-150细胞中,诱导PRDM1的表达不明显,但是在OCI-Ly10-miR-150细胞中,PRDM1的表达水平显著上调。结论1. hsa-miR-150与c-myb表达模式相反,hsa-miR-150可负性调控c-myb的表达。2.功构建了OCI-Ly10-miR-150和Raji-miR-150两株稳定表达miR-150的B淋巴瘤细胞亚系,hsa-miR-150具有抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡作用。3. hsa-miR-150可以诱导Raji和OCI-Ly10细胞系向末端B细胞方向分化,诱导机制与其下调其靶基因c-myb的表达有关。创新之处1.从正常B淋巴细胞到各株淋巴瘤细胞观测hsa-miR-150的表达未见文献报道。2..成功构建了OCI-Ly10-miR-150和Raji-miR-150两株稳定表达miR-150的B淋巴瘤细胞亚系,发现hsa-miR-150具有抑制肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡作用。3.发现并提出上调hsa-miR-150表达可诱导Raji和OCI-Ly10细胞朝末端B细胞方向分化,其机制与下调其靶基因c-myb的表达有关。