棉花盐胁迫诱导cDNA文库的构建及耐盐基因的筛选与鉴定

论文摘要

棉花是较耐盐碱的作物之一,对改良和有效利用盐渍地具有重要意义。但棉花的耐盐能力有限,要在盐碱地广泛种植,必须进一步提高棉花的耐盐能力。传统的常规育种方法无法大幅度提高棉花的耐盐性,分子生物学的发展,为大幅度提高棉花的耐盐性提供了新的方法。但要通过转基因技术提高棉花的耐盐性,首先要了解棉花耐盐的分子机制,并解决基因来源问题。而这两个问题解决的基础首先是要克隆到足够多的与棉花耐盐相关的基因。而目前大规模克隆与耐盐相关基因的最有效方法之一就是cDNA文库筛选法。本研究以耐盐棉花品种中棉19号为材料,构建了棉花盐胁迫诱导cDNA文库,对文库的筛选鉴定表明,构建的棉花子叶cDNA文库质量较好。通过反相Northern差异筛选法获得17个与盐胁迫相关的新基因。并选择5号、17号、21号和30号克隆进行功能研究分析。研究发现5号和17号克隆属于棉花金属硫蛋白基因家族成员,30号克隆是PPIC型（PPIC- PPIASE-2）-肽酰脯氨酰顺反异构酶（parvulin-type peptidyl-prolyl cis/trans isomerase）,而21号克隆可能是一种紫外线B抑制蛋白。金属硫蛋白（Metallothionein,MT）是一类低分子量（6000～9000Da）、高Cys含量、具有金属结合能力的多肽,它具有独特的氨基酸排列顺序,即多肽的N端和C端具有两个富含Cys的金属结合结构域,其中的Cys按CXnC的方式排列。MT基因和蛋白广泛存在于动物、植物、真菌、绿藻中。植物金属硫蛋白按结构特点分为三类。5号克隆编码的GhMT1与17号克隆编码的GhMT2为棉花I类金属硫蛋白。对这两个基因进行序列比较、表达分析和功能鉴定。主要结果如下:1. 5号克隆和17号克隆的序列同源性分析表明,二者的核苷酸序列的同源性为91.15%,氨基酸同源性为85.94%,可以断定二者为同一棉花基因家族成员。该基因家族编码蛋白与覆盆子、葡萄、中华猕猴桃、番木瓜等许多植物中的I类金属硫蛋白的同源性为70.1%,具有典型的植物I类金属硫蛋白序列特点,聚类分析表明该棉花基因家族与覆盆子、葡萄、中华猕猴桃、番木瓜等植物的I类金属硫蛋白具有较近的亲缘关系。因此,可以断定二者属于植物I类金属硫蛋白,命名为GhMT1、GhMT2。2. Northern杂交分析表明GhMT1受NaCl胁迫诱导表达,在一定的时间范围内其表达水平随NaCl诱导时间的延长而增加,但是在盐胁迫条件下不能被快速诱导。GhMT1也能被CuSO4、ZnSO4、低温、干旱、ABA和乙烯诱导,说明GhMT1具有金属硫蛋白受重金属诱导的功能,也说明对盐胁迫的非专一性,而是受各种非生物胁迫的诱导。同时暗示着GhMT1受ABA和乙烯信号途径的调控,可能是ABA、乙烯信号途径的靶基因。3. Northern表达分析还表明在抗氧化剂N-乙酰基-L-半胱氨酸（N-Acetyl-L-cysteine,NAC）存在的条件下,GhMT1不受NaCl、低温、干旱、百草枯（PQ,paraquat）的诱导。对过氧化氢相对水平的测定结果表明,NAC有效的抑制了NaCl、低温、干旱胁迫条件下过氧化氢水平。说明活性氧自由基是非生物胁迫诱导GhMT1及其同源家族表达的重要信号物质。4.GhMT1和GhMT2在转基因烟草中过量表达,用GhMT1和GhMT2特异探针进行检测,Northern杂交结果说明GhMT1和GhMT2只在转基因植株中表达。同野生型相比,超表达GhMT1和GhMT2的转基因烟草在200mM NaCl、300mM NaCl条件下以及4℃条件下与25%PEG条件下较好的生长。说明GhMT1及其同源家族能提高植物的抗盐能力,也能提高植物的抗其它主要非生物胁迫的能力。5.对转基因烟草生理指标测定结果表明,在盐、4℃、25%PEG胁迫条件下转基因烟草SOD酶活性明显高于野生型烟草。说明GhMT1能够提高植物清除活性氧自由基能力,从而提高植物抗盐、抗低温及抗干旱等非生物胁迫的能力。6.对GhMT1体外结合Zn2+能力的测定表明,GhMT1具有金属硫蛋白家族能够结合金属离子的特性,每一分子GhMT1最多能结合5个锌离子。肽酰脯氨酰顺反异构酶（peptidyl proline cis/trans isomerase,PPIase）是一种催化肽酰-脯氨酰的肽键顺反异构的一类酶,在进化上高度保守,成员多样,并且分布广泛,在生物体的生理过程中发挥重要的作用。脯氨酰异构酶超家族可以分为FK506结合蛋白（FK506-binding proteins,FKBPs）、亲环素（cyclophilins,Cyp）和Parvulins三个独立的蛋白家族,每个家族又有众多成员。30号克隆编码的GhPPI是Parvulins家族中的肽酰脯氨酰顺反异构酶,对这个基因进行序列比较、表达分析和功能鉴定。主要结果如下:1.序列同源比较分析表明,棉花GhPPI具有PPIC- PPIASE-2（PPIC型-肽酰脯氨酰顺反异构酶）保守区,是parvulin家族顺反异构酶中的成员,酶学分类为（EC 5.2.1.8）。同源蛋白聚类分析表明GhPPI和拟南芥AtPIN2以及水稻中的肽酰脯氨酰顺反异构酶具有高达92%以上的同源性,与人的Par14和Par17也有高达55%的同源性。棉花GhPPI除具有顺反异构酶保守区外,N端还具有富含Lys的碱性氨基酸区。通过综合比较分析表明,棉花GhPPI可能是parvulin家族人Par17类型成员。2.跨膜区分析表明,棉花GhPPI没有跨膜区。GhPPI-GFP融合蛋白洋葱表皮亚细胞定位表明,GhPPI主要定位于细胞核中,并与染色体结合。核定位信号分析表明,没有明显的核定位信号。前人研究表明Par14和Par17的核定位信号位于N端富含Lys的碱性氨基酸区,并不剪切去,并且N端的碱性氨基酸区是结合DNA所必需的。推测GhPPI与Par14和Par17具有高度同源的N端富含碱性氨基酸区也具有相似功能。3.通过原核表达纯化到了棉花GhPPI蛋白,选用N-Succingl-Ala-Ala-Pro-Phe-4- nitroanilides底物,对棉花GhPPI蛋白顺反异构酶活性进行分析测定。结果表明棉花GhPPI蛋白具有较低的顺反异构酶活性。棉花GhPPI蛋白是植物中第一个鉴定的具有顺反异构酶活性的parvulin家族中的成员。4.用Northern杂交技术进一步分析棉花GhPPI的内源表达情况。结果显示,GhPPI有一定的本底表达水平,受300mM NaCl诱导后,其表达水平升高,并在一定的时间范围内随NaCl诱导时间的延长而增加。说明GhPPI顺反异构酶活性与植物抗胁迫有一定的关系。5.前人将AtPIN2分类到parvulin家族人hPar14类型中,通过对我们实验结果分析讨论发现,AtPIN2与GhPPI同源性高达93%,将两者归类到的parvulin家族人hPar17类型更科学。GhPPI的许多研究结果都暗示GhPPI与hPar17功能类似,推测GhPPI可能也具有hPar17的相似功能。6.从拟南芥中克隆到棉花GhPPI在拟南芥中的同源基因AtPIN2基因,构建了AtPIN2基因的超表达、反义表达载体和RNAi干涉载体,并获得相应的转基因植株。发现AtPIN2基因RNAi干涉的T0代拟南芥幼苗生长迅速。转基因拟南芥植株的获得,为通过采用反向遗传学方法研究AtPIN2和GhPPI等parvulin家族基因功能创造了条件。高等植物的光受体可分为4种类型:光敏色素（phytochrome）、隐花色素（cryptochrome）、趋光素（phototropin）和超级色素（superchrome）。其中,隐花色素和趋光素都能吸收蓝光,属于蓝光受体。21号克隆GhUVB1可能编码一种紫外线B抑制蛋白。对GhUVB1进行初步的结构与功能鉴定分析,结果如下:1.氨基酸序列多重对比分析表明棉花GhUVB1编码蛋白在第60个氨基酸到第114个氨基酸的区域内具有“aaaxxxxmxxpxxaxaaxxxxxpslknfllsixxggxvxxxixgxvxxvsnfdpvk”高度保守区域,与之同源性较高的蛋白多数属于紫外线B抑制蛋白。进一步同源分析比较表明,棉花GhUVB1与光系统II的X亚基（PsbX类似蛋白）也有一定的同源性,也可能是PsbX类似蛋白。2.跨膜区分析表明,棉花GhUVB1没有跨膜区。GhUVB1-GFP绿色荧光融合蛋白洋葱内表皮亚细胞定位研究发现,GhUVB1主要定位于细胞膜上,而细胞核等部位也发现有绿色荧光的存在,但分布不均匀,推测GhUVB1也定位于细胞核膜上。这与GhUVB1蛋白的跨膜区理论分析相吻合。3.构建了棉花GhUVB1蛋白的超表达载体,并转化到拟南芥中超表达,结果发现超表达棉花GhUVB1蛋白的拟南芥T0代植株,与野生型相比,植株明显矮小,且开花期平均延迟7天左右。这一重要异常现象为下一步揭示棉花GhUVB1蛋白功能提供了重要线索。4.棉花GhUVB1蛋白定位于质膜与核膜或核内的,理论上是与紫外光信号接受与传递密切相关的蛋白,超表达该蛋白的转基因拟南芥植株出现生长延迟现象,这一现象与隐花色素CRY1的表现相似。推测棉花GhUVB1可能是一种隐花色素或与隐花色素密切相关的蛋白。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 植物耐盐研究进展
• 1.2 植物的盐胁迫
• 1.2.1 盐胁迫对植物的危害
• 1.2.1.1 渗透胁迫
• 1.2.1.2 离子胁迫
• 1.2.1.3 破坏正常生理代谢
• 1.2.2 植物抗盐方式
• 1.2.2.1 植物的避盐
• 1.2.2.2 植物的耐盐
• 1.2.2.3 盐生植物的分类
• 1.2.3 植物盐胁迫适应机制
• 1.2.3.1 维持体内离子和渗透平衡
• 1.2.3.2 胁迫损害控制和修复
• 1.2.3.3 生长调节控制
• 1.2.4 盐胁迫信号途径
• 1.2.4.1 MAPK信号传递途径
• 2+偶联的CDPK 信号途径'>1.2.4.2 Ca²⁺偶联的CDPK 信号途径
• 2+偶联的SOS 信号途径'>1.2.4.3 Ca²⁺偶联的SOS 信号途径
• 1.3 棉花的耐盐性
• 1.3.1 棉花的耐盐机制
• 1.3.1.1 拒盐
• 1.3.1.2 耐盐性
• 1.4 棉花耐盐基因及其主要研究进展
• 1.4.1 棉花基因克隆的主要途径
• 1.4.2 耐盐基因的研究方法
• 1.5 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 植物材料培养与处理
• 2.1.3 表达载体和菌株
• 2.1.4 实验引物
• 2.1.5 其他材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 RNA 提取
• 2.2.1.1 利用RNeasy Plant Mini Kit 提取总RNA
• 2.2.1.2 利用TRIZOL 试剂盒提取RNA
• 2.2.1.3 异硫酸氰胍-酸性酚-LiCl法
• 2.2.2 RNA 纯化
• 2.2.3 cDNA 第一条链的合成
• 2.2.4 双链DNA的合成
• 2.2.5 蛋白酶K消化dscDNA
• 2.2.6 SfiI 消化dscDNA
• 2.2.7 双链文库DNA的纯化
• 2.2.8 cDNA 与λTriplEx2 载体连接、包装及效价测定
• 2.2.8.1 cDNA 与λTriplEx2 载体连接
• 2.2.8.2 λTriplEx2-cDNA的包装
• 2.2.8.3 λTriplEx2-cDNA原始文库的效价测定
• 2.2.9 λTriplEx2-cDNA 文库的扩增及效价测定
• 2.2.9.1 λTriplEx2-cDNA 文库的扩增
• 2.2.9.2 λTriplEx2-cDNA 扩增文库的效价测定
• 2.2.10 λTriplEx2-cDNA 的筛选
• 2.2.11 λTriplEx2-cDNA 转化pTriplEx2
• 2.2.12 DNA 片段与克隆载体的连接
• 2.2.13 大肠杆菌 DH5α感受态的制备
• 2.2.14 大肠杆菌细胞的转化
• 2.2.15 序列测定
• 2.2.16 质粒 DNA 的提取
• 2.2.17 凝胶电泳中 DNA 片段的回收
• 2.2.18 Northern 杂交
• 2.2.18.1 RNA 提取及电泳
• 2.2.18.2 转膜及烘膜
• 2.2.18.3 探针合成
• 2.2.18.4 预杂交及杂交
• 2.2.19 Southern 杂交
• 2.2.19.1 基因组 DNA 的提取
• 2.2.19.2 限制性内切酶消化
• 2.2.19.3 转膜
• 2.2.19.4 探针合成
• 2.2.19.5 预杂交及杂交
• 2.2.20 植物表达载体的构建与转化
• 2.2.20.1 植物正义表达载体的构建
• 2.2.20.2 农杆菌感受态细胞制备及转化
• 2.2.20.3 农杆菌的培养
• 2.2.20.4 农杆菌介导的烟草的转化
• 2.2.21 原核表达及蛋白质纯化
• 2.2.21.1 实验试剂配制
• 2.2.21.2 原核表达载体的构建
• 2.2.21.3 E.coli BL21 原核表达的诱导
• 2.2.21.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.2.21.5 目的蛋白的纯化
• 2.2.22 蛋白质结合金属离子能力的测定
• 2.2.23 叶绿素含量的测定
• 2.2.24 过氧化氢含量的测定
• 2.2.24.1 原理
• 2.2.24.2 试剂
• 2.2.24.3 样品提取和测定
• 2.2.25 超氧化物歧化酶（SOD）活力测定
• 2.2.25.1 原理
• 2.2.25.2 试剂
• 2.2.25.3 操作方法和步骤
• 2.2.26 考马斯亮蓝 G-250 法测定蛋白质含量
• 2.2.26.1 原理
• 2.2.26.2 试剂
• 2.2.26.3 测定与计算
• 2.2.27 融合蛋白表达载体转化洋葱表皮细胞
• 2.2.28 脯氨酰顺反异构酶活性测定
• 3 结果与分析
• 3.1 棉花耐盐cDNA文库的构建与筛选鉴定
• 3.1.1 棉花总RNA的提取
• 3.1.2 棉花cDNA文库构建及效价测定
• 3.1.2.1 棉花cDNA原始文库构建
• 3.1.2.2 棉花cDNA原始文库效价测
• 3.1.3 棉花cDNA重组克隆效率测定
• 3.1.4 棉花cDNA原始文库的扩增与效价测定
• 3.1.5 棉花cDNA文库的筛选
• 3.1.6 棉花盐胁迫诱导cDNA文库的筛选结果
• 3.2 棉花GhMT1和GhMT2的克隆与功能鉴定
• 3.2.1 5号克隆GhMT1和17号克隆GhMT2的生物信息学分析
• 3.2.1.1 5号和17号克隆的核苷酸序列与氨基酸序列
• 3.2.1.2 5号和17号克隆的同源性分析
• 3.2.1.3 金属硫蛋白GhMT1和GhMT2跨膜结构的分析
• 3.2.2 棉花金属硫蛋白GhMT1及GhMT2的功能分析
• 3.2.2.1 GhMT1内源表达分析
• 3.2.3 GhMT1与GhMT2在烟草中超表达及转基因烟草的抗逆性分析
• 3.2.3.1 植物表达载体的构建
• 3.2.3.2 转基因烟草抗逆性分析
• 3.2.4 GhMT1 的原核诱导表达与GhMT1体外结合锌离子能力的测定
• 3.2.4.1 GhMT1基因的原核表达
• 3.2.4.2 GhMT1蛋白的纯化
• 2+相结合的检测'>3.2.4.3 GhMT1蛋白与Zn²⁺相结合的检测
• 3.3 棉花GhPPI的克隆与功能初步鉴定
• 3.3.1 棉花 GhPPI 的克隆与生物信息学分析
• 3.3.1.1 棉花 GhPPI 的核苷酸序列与氨基酸序列
• 3.3.1.2 氨基酸序列同源性分析
• 3.3.1.3 GhPPI 同源蛋白的聚类分析
• 3.3.1.4 GhPPI 蛋白的等电点分析
• 3.3.2 棉花 GhPPI 蛋白的亚细胞定位
• 3.3.2.1 棉花 GhPPI 克隆编码蛋白的跨膜结构分析
• 3.3.2.2 棉花 GhPPI 蛋白的亚细胞定位
• 3.3.3 棉花 GhPPI 肽酰脯氨酰顺反异构酶活性鉴定
• 3.3.3.1 GhPPI 基因的原核表达
• 3.3.3.2 棉花 GhPPI 蛋白的纯化
• 3.3.3.3 棉花 GhPPI 顺反异构酶活性分析
• 3.3.3.4 不同菌株来源的 GhPPI 顺反异构酶活性比较
• 3.3.4 棉花 GhPPI 内源表达分析
• 3.3.5 拟南芥中 GhPPI 的同源基因 AtPPI 克隆与功能分析
• 3.3.5.1 拟南芥基因 AtPPI 的克隆
• 3.3.5.2 AtPPI 基因植物超表达载体与反义表达载体的构建与转化
• 3.3.5.3 植物 RNAi 表达载体的构建与转化
• 3.3.5.4 拟南芥转化与筛选
• 3.3.5.5 转基因拟南芥的基因组 DNA PCR 鉴定
• 3.3.5.6 转基因拟南芥 T1 代萌发检测
• 3.4 棉花GhUVB1的克隆与功能初步分析
• 3.4.1 棉花 GhUVB1 的克隆与生物信息学分析
• 3.4.1.1 棉花 GhUVB1 的核苷酸序列与氨基酸序列
• 3.4.1.2 棉花GhUVB1氨基酸序列同源比较分析
• 3.4.2 棉花 GhUVB1 蛋白跨膜区预测
• 3.4.3 棉花 GhUVB1 蛋白亚细胞定位
• 3.4.4 GhUVB1在拟南芥中超表达分析
• 3.4.4.1 GhUVB1超表达载体的构建
• 3.4.4.2 转基因拟南芥 T0 代的筛选
• 3.4.4.3 转基因拟南芥 T0 代表型观察
• 3.4.4.4 转基因拟南芥 T1 代表型观察
• 4 讨论
• 4.1 棉花盐胁迫诱导 cDNA 文库的构建与筛选鉴定
• 4.2 GhMT1 与 GhMT2 的结构和功能鉴定
• 4.2.1 GhMT1 与 GhMT2 的结构和功能
• 4.2.2 GhMT1 与 GhMT2 可能信号途径及机制
• 4.2.3 GhMT1 及其同源家族的研究展望
• 4.3 棉花 GhPPI 顺反异构酶结构与功能分析
• 4.3.1 肽酰脯氨酰顺反异构酶的分类与功能
• 4.3.2 棉花 GhPPI 顺反异构酶的结构和功能
• 4.4 棉花 GhUVB1 基因功能初步分析
• 5 结论
• 5.1 棉花盐胁迫诱导cDNA 文库的构建
• 5.2 棉花金属硫蛋白 GhMT1 与 GhMT2 功能鉴定
• 5.3 棉花 GhPPI 顺反异构酶的功能分析
• 5.4 棉花 GhUVB1 蛋白定位与基因功能初步分析
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 入学以来已发表论文及成果