棉铃虫对Bt毒素Cry1Ac抗性的分子遗传机理研究

论文摘要

转基因棉花的大规模种植对控制鳞翅目害虫的为害发挥了重要作用,但害虫长期处于转基因作物Bt毒素的高压选择下,害虫对Bt作物的抗性问题将不容忽视。昆虫对Bt的抗性是一种遗传性状,其抗性基因就位于昆虫体内,参与体内各种代谢过程。目前,还没有一致的结论阐明昆虫对Bt毒素的抗性机制,其抗性机制是复杂和多样的。害虫抗性的遗传机制研究不仅有助于了解抗性本质和特征,而且是制定抗性治理策略的基础,是研究抗性的一个重要工具。无论是昆虫抗性适合度研究,还是昆虫抗性机理研究,试验材料都是非常重要的。通常研究害虫抗性都是通过比较抗、感品系之间的差异,所以尽可能缩小二者之间的差异,可以更大概率的找到抗性差异,这对研究害虫抗性,尤其是研究害虫抗性基因的DNA分子遗传标记是至关重要的。近等基因系(NIL)是一组遗传背景相同或相近,只在个别染色体区段上存在差异的品系,如果一对近等基因系在目标性状上表现差异,那么,凡是能在这对近等基因系间揭示多态性的分子标记,就可能位于目标基因的附近。因此,利用近等基因系材料,可以寻找与目标基因紧密连锁的分子标记。通过10多年的室内筛选,本研究室已经获得了对Bt具有较高抗性的棉铃虫种群,正在进一步研究其抗性机制。用大约一年半的时间,我们建立了棉铃虫抗性近等基因系。经过一系列回交和抗性再筛选,我们得到一个与敏感品系整个基因组具有至少93%的同源性、又具有较高抗性倍数的抗性近等基因系。以棉铃虫室内Bt抗性品系、敏感品系为试验材料,我们研究了棉铃虫对Bt毒素抗性的分子遗传机理。体重抑制法测定结果表明,用含区分剂量1.5μg/mL CrylAc毒料饲喂棉铃虫回交后代(BC)5d后,存活虫数:死亡虫数的比例为1:1,证实该虫对Bt毒素CrylAc的抗性为常染色体上不完全隐性遗传。利用AFLP分子标记技术,研究棉铃虫对Bt毒素CrylAc抗性的分子遗传机理,结果发现抗性基因BtR与AFLP标记EaaMctc2连锁,位于第4连锁群上EaaMctc2与EcaMcac1两个多态性标记之间,遗传距离分别为12.2cM±6cM和13.1cM±6cM。对标记EaaMctc2回收、克隆、测序,仅出现对于301bp处的单一条带。序列分析结果表明,该片段与GenBank中已知序列同源性较低。昆虫对Bt产生抗性后,在没有选择压力时,有些昆虫的抗性表现出不同程度的衰退,而有些则趋于稳定。棉铃虫抗性稳定性研究结果表明,在没有Bt选择压下,即用未加入Bt毒素的正常人工饲料饲养棉铃虫抗性品系五代,抗性倍数呈现快速下降的趋势,从3626.67倍下降到1033.33倍,下降了2593.34倍,抗性极不稳定。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1.前言
• 1.1 文献综述
• 1.1.1 苏云金芽孢杆菌
• 1.1.2 转Bt基因作物的研究与应用
• 1.1.3 昆虫对Bt及转基因作物的抗性现状
• 1.1.4 昆虫对Bt抗性稳定性的研究
• 1.1.5 昆虫对Bt抗性的遗传研究
• 1.1.6 昆虫对Bt抗性的分子遗传机制研究
• 1.1.7 Bt抗性治理策略的研究
• 1.1.8 AFLP分子标记技术及其在昆虫学研究中的应用
• 1.2 本论文研究目的和意义
• 2.材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 昆虫材料
• 2.1.2 Bt毒素
• 2.1.3 主要实验仪器及试剂
• 2.1.4 主要生化试剂及缓冲液配制
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 棉铃虫抗Bt毒素Cry1Ac近等基因系的建立
• 2.2.2 棉铃虫对Bt毒素Cry1Ac的抗性遗传分析
• 2.2.3 棉铃虫抗BtCry1Ac毒素AFLP标记体系的建立
• 2.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.5 银染
• 2.2.6 数据统计与分析
• 2.2.7 AFLP标记的回收、克隆及序列特征
• 2.2.8 棉铃虫对Bt毒素Cry1Ac抗性稳定性的初步监测
• 3.结果与分析
• 3.1 棉铃虫抗Bt毒素Cry1Ac近等基因系的建立
• 3.2 棉铃虫对Bt毒素Cry1Ac抗性遗传分析
• 3.3 棉铃虫抗BtCry1Ac毒素AFLP标记体系的建立
• 3.3.1 基因组DNA含量及纯度测定
• 3.3.2 酶切-连接反应
• 3.3.3 连锁群的确定以及抗性相关检验
• 3.3.4 连锁图谱框架构建及定位抗性基因
• 3.3.5 AFLP标记的回收、克隆及序列特征
• 3.3.6 棉铃虫对Bt毒素Cry1Ac抗性稳定性的初步监测
• 4.讨论
• 4.1 棉铃虫抗Bt近等基因系的建立
• 4.2 害虫抗Bt品系对Bt毒素和制剂的抗性遗传
• 4.3 棉铃虫对Bt毒素抗性稳定性的监测研究
• 4.4 分子标记分析法研究抗性遗传
• 4.5 关于本工作深入进行的几点想法
• 4.5.1 采用近等基因系试验材料优化AFLP分子标记体系
• 4.5.2 棉铃虫抗Bt基因相关标记EaaMctc2序列的进一步分析
• 4.5.3 棉铃虫Bt抗性稳定性进一步监测
• 5.结论
• 5.1 建立了棉铃虫抗Bt毒素Cry1Ac近等基因系
• 5.2 分析了棉铃虫对Bt毒素Cry1Ac的抗性遗传
• 5.3 构建了棉铃虫抗性遗传图谱并对抗性基因进行初步定位
• 5.4 实验室内初步测定棉铃虫对Bt毒素Cry1Ac抗性稳定性变化
• 致谢
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文