禽网状内皮组织增生病病毒囊膜基因gp90的克隆表达及间接ELISA方法的初步建立

论文摘要

禽网状内皮组织增生症是一种由反转录病毒科的禽网状内皮增生症病毒（reticuloendotheliosis virus, REV）引起的鸡、鸭、鹅及其他禽类发生的病理综合征,REV感染可引起肿瘤、生长矮小综合征、腺胃炎,更重要的是其感染胸腺和腔上囊等主要免疫器官,引起组织器官萎缩,降低家禽的免疫能力甚至导致免疫抑制,极大的为病毒和细菌的继发感染提供了便利。据报道RE在我国流行趋势有扩大的倾向,其在我国家禽的感染率已达20%～30%,对REV检测预防意义重大。通过克隆、表达REV免疫显性蛋白,本实验旨在建立一种具有快速、准确的ELISA检测方法。根据禽网状内皮组织增生症病毒（reticuloendotheliosis virus, REV） SNV株前基因组cDNA序列,经生物信息学软件分析,发现gp90基因两端抗原活性不高且疏水性强,不利于原核表达的顺利进行。自行设计并合成引物,两端添加限制性内切酶位点EcoRⅠ、HindⅢ,以四川分离株REV-SC1为模板,扩增REV囊膜基因gp90抗原性、亲水性较高的121～1023 bp基因片段,避开两端抗原性低、疏水性强区域；纯化回收目的基因片段,将目的基因克隆至pMD-19T载体,构建重组克隆载体pMD-19T-gp90,转化至大肠杆菌工程菌DH5α,对重组克隆质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定,将阳性克隆重组子送往生物公司测序,对反馈序列进行拼接、比对和分析；使用限制性内切酶位点EcoRⅠ、HindⅢ对重组克隆载体pMD-19T-gp90和原核表达载体pET-32a（+）进行双酶切,纯化回收gp90基因片段和线性质粒pET-32a（+）,将基因片段按正确的阅读框架定向克隆至pET-32a （+）,构建重组原核表达质粒pET-32a（+）-gp90,转化大肠杆菌BL21 （DE3）,使用PCR方法和双酶切方法鉴定阳性重组子,鉴定无误后送往生物公司测序,对测序结果进行仔细验证,对比克隆测序结果,重点检查是否有基因突变情况；以IPTG对重组大肠杆菌进行诱导表达,使用SDS-PAGE方法和Western-blot方法分别鉴定表达产物大小和抗原性,对表达产物在细菌中的主要存在形式进行鉴定。对包涵体洗涤、纯化、复性,探讨以重组gp90蛋白为包被抗原初步建立检测REV的间接ELISA方法。结果表明：1)成功扩增gp90基因,重组克隆载体pMD-19T-gp90测序结果表明,REV-SC1株gp90核苷酸序列与GenBank已发表序列同源性最高为99%,于231位、870位发生了2个碱基突变,进化树分析表明,其与黑龙江分离毒株ZD0708、JLR0903亲缘关系最近；2) SDS-PAGE电泳鉴定表达蛋白约为45 Kd,与预期分子量大小相符,Western-blot结果表明重组蛋白具有生物学活性,表达产物主要以包涵体形式存在于细菌内部,对包涵体进行变性、洗涤、复性操作,获得了较纯的目的蛋白；3) ELISA检测方法：最佳抗原稀释度为1：20（包被浓度约为1.5 mg/ml）,一抗稀释度为1：320,阳性血清判定临界值为0.126,特异性、敏感性、重复性试验结果良好。本试验探讨克隆表达REV免疫显性gp90蛋白,并对其在ELISA检测方面的应用作了积极有益的探索,为其商品化、大规模应用奠定了坚实的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 文献综述及选题目的意义
• 1 病原学
• 1.1 病毒分类
• 1.2 理化特性
• 1.3 核酸与蛋白
• 2 病毒的复制、增殖
• 2.1 病毒的吸附与穿入
• 2.2 RNA基因组的反转录
• 2.3 整合
• 2.4 转录、翻译
• 2.5 装配与释放
• 3 流行病学
• 3.1 宿主
• 3.2 传播方式及途径
• 4 临床症状及病理变化
• 4.1 急、慢性肿瘤的形成
• 4.2 矮小综合征
• 4.3 腺胃炎
• 4.4 免疫抑制
• 5 诊断研究进展
• 5.1 临床诊断
• 5.2 病毒的分离
• 5.3 间接免疫荧光试验（IFA）
• 5.4 聚合酶链式反应（PCR）
• 5.5 ELISA检测方法
• 5.6 其他检测方法
• 6 REV的防治
• 7 选题目的及意义
• 第二部分 试验研究
• 第一章 网状内组织增生症病毒囊膜基因gp90的克隆测序
• 1 试验材料与设备
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 主要培养基和试剂的制备
• 2 试验方法
• 2.1 引物设计及合成
• 2.2 感染REV的脾脏细胞总DNA的提取
• 2.3 gp90基因的扩增与纯化回收
• 2.3.1 目的基因的扩增
• 2.3.2 凝胶电泳检测PCR产物
• 2.3.3 目的基因的纯化回收
• 2.3.4 大肠杆菌DH5 α感受态细胞制备
• 2.3.5 目的基因的连接
• 2.3.6 转化
• 2.3.7 重组克隆的鉴定
• 2.3.8 gp90基因序列测定及序列分析
• 3 试验结果
• 3.1 gp90基因的扩增
• 3.2 重组克隆质粒的筛选与鉴定
• 3.3 重组质粒测序结果及分析
• 3.4 进化树构建
• 4. 讨论
• 4.1 引物的设计及PCR扩增
• 4.2 gp90基因克隆测序分析
• 5 结论
• 第二章 禽网状内皮组织增生症病毒囊膜基因gp90的原核表达以及间接ELISA方法的初步建立
• 1 试验材料与设备
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要溶液及试剂的配置
• 1.4 主要仪器
• 2 试验方法
• 2.1 gp90基因片段原核表达重组质粒的构建
• 2.1.1 菌种复苏培养
• 2.1.2 质粒抽提和大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞制备
• 2.1.3 质粒载体pMD-19T-gp90与pET-32a（+）的酶切回收
• 2.1.4 原核表达载体pET-32a（+）-gp90的构建
• 2.1.5 连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞
• 2.2 重组原核表达质粒的鉴定
• 2.2.1 菌落PCR
• 2.2.2 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3 重组表达质粒pET-32a（+）-gp90的诱导表达
• 2.3.1 最佳诱导条件的选择
• 2.3.2 重组菌的大规模诱导表达
• 2.3.3 表达产物的鉴定
• 2.3.4 表达产物的初步纯化
• 2.4 间接ELISA检测方法的建立
• 2.4.1 方阵滴定试验确定最佳抗原、一抗工作浓度
• 2.4.2 临界值的确定
• 2.4.3 特异性试验
• 2.4.4 敏感性试验
• 2.4.5 稳定性试验
• 3 试验结果
• 3.1 gp90基因原核表达载体的构建
• 3.2 重组原核表达质粒测序
• 3.3 重组质粒的诱导表达
• 3.3.1 pE-32a（+）-gp90质粒IPTG最佳诱导浓度的确定
• 3.3.2 pET-32a（+）-gp90质粒诱导表达时间的优化
• 3.3.3 pET-32a（+）-gp90质粒诱导温度的选择
• 3.3.4 表达产物的可溶性及纯化效果分析
• 3.3.5 Western-blot分析
• 3.4 间接ELISA检测方法的建立
• 3.4.1 最佳抗原抗体工作浓度的确定
• 3.4.2 临界值的确定
• 3.4.3 特异性试验
• 3.4.4 敏感性试验
• 3.4.5 稳定性试验
• 4 讨论
• 4.1 表达载体pET-32a（+）和宿主菌BL21（DE3）的选择
• 4.2 原核表达载体的构建和鉴定
• 4.3 重组质粒的诱导表达和蛋白纯化
• 4.3.1 重组质粒表达条件的优化
• 4.3.2 蛋白质的纯化
• 4.4 ELISA检测方法的建立
• 5 小结
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢