利用灌注式生物反应器体外构建大段组织工程骨的研究

论文摘要

研究背景组织工程骨为临床大段骨缺损的治疗提供了可能,同时也避免了自体骨、异体骨移植所带来的不利因素,如供区疼痛、感染、排斥反应等。近年来,以生物相容性良好的生物材料为支架,复合有分化潜能的骨髓基质干细胞,在体外构建组织工程骨治疗大段骨缺损的理念已逐渐被人们所接受。但是体外构建大段组织工程骨一直面临着种子细胞无法在材料上均匀分布,并在材料内部增殖与分化的瓶颈,这严重制约了骨组织工程的发展。当下各类生物反应器的出现,有望打破这一瓶颈。生物反应器是一种可严格监控,培养环境可精细调节,操作条件可控的细胞生物、生化培养装置。目前许多学者通过使用生物反应器在体外模拟一个有别于传统二维培养方式的三维动态培养环境。动力性三维培养的生物反应器主要有搅拌式生物反应器、旋转壁式生物反应器、膜式生物反应器和灌注式生物反应器。对于骨组织工程而言,应用灌注式生物反应器优势最为明显。灌注式生物反应器的原理是通过蠕动泵的作用,不断泵入新鲜培养基,泵出代谢废产物,经由灌流速率的调节可使营养物质和代谢废产物与细胞之间的物质传递,种子细胞-生物材料结构体内细胞外基质的截留及流体产生的剪切力之间达到平衡,组织培养性强。但是,如何最大限度地减少非灌流路径,提高灌注效率,平衡灌注过程中传质效率与流体剪切力对细胞的破坏一直是灌注式生物反应器设计中亟待突破的问题。目的1.研制一种能够应用于大段组织工程骨体外构建的三维灌注式生物反应器。2.研究体外全骨髓培养法分离培养Sprague Dwley （SD）大鼠骨髓基质干细胞（Bone Marrow Stromal Cells, BMSCs）的生物学特征及多向分化潜能。3。比较两种灌注培养方式对BMSCs在大段材料上分布、增殖与分化的影响。方法1.灌注式生物反应器的构建与性能测试反应器的设计与构建原则：①在可控的力学和物化环境里进行长期培养;②确保流体垂直流经整个支架内部,最大限度地减少非灌流路径；③可进行模块式组合,能同时培养多个工程化组织；④保证流体可重复、可控制且连续地流经整个培养体系。⑤整个系统要便于灭菌,并在整个培养过程中保持无菌状态。⑥系统操作简单合理,避免繁琐操作引起不可预知因素的干扰。反应器的性能测试：（1）机械性能与安全性评估：对构建的反应器进行系统密闭性、细菌学检测；测定系统流量,计算流体剪切应力；对反应器的构建材料进行细胞毒性检测。（2）反应器组织培养性能评估：使用eGFP-BMSCs作为种子细胞,与多孔β—磷酸三钙陶瓷（β-Tricalcium Phosphate, p-TCP）材料复合后置于反应器内培养。实验组：用反应器灌注培养；对照组：静止培养法培养。于第3、7、14d进行细胞活力测定,扫描电镜和荧光显微镜观察细胞在材料上的分布与增殖情况（n=3）。2.SD大鼠BMSCs的分离、培养与鉴定SD大鼠BMSCs的分离、培养：断颈处死2周龄SD大鼠,置75%酒精浸泡15min,在超净工作台中无菌取出大鼠股骨与胫骨,完全去除骨骼附着软组织,采用无菌生理盐水冲洗髓腔1-2次,直接收集于离心管中。以1000 r/min离心10min,弃上清,采用SD大鼠BMSCs标准培养液重悬计数,种植于25cm2培养瓶中,置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养。24h后换液,以后每2-3d换液1次。达到80%～90%融合时,采用0.25%胰酶进行消化传代,分组培养。SD大鼠BMSCs的鉴定：选取生长良好的第4代（P4）细胞,使用流式细胞仪进行表面抗体检测。分别对第三代（P3）细胞进行成骨、成软骨、成脂肪方向诱导后,行ALP染色、茜素红染色、甲苯胺兰染色、阿尔新蓝染色、油红O染色,进行BMSCs多向分化潜能的鉴定。3.两种灌注培养方式对大鼠BMSCs在大段材料上分布、增殖与分化的影响使用负压抽吸法将SD大鼠BMSCs复合到β-TCP材料后,置入充满成骨诱导培养基的灌注式生物反应器。根据培养方式的不同分为三组。对照组（静止培养组）：不开启蠕动泵,静止培养；实验A组（持续灌注培养组）：开启蠕动泵,以10rpm的转速持续灌注培养至实验结束；实验B组（间断灌注培养组）：开启蠕动泵,以10rpm的转速间断灌注培养,白天每隔3h灌注培养1h,夜间12：00至次日8：00持续灌注培养。按时间点收获细胞-支架材料复合物后（n=3）进行扫描电镜观察并测定支架上各部位的细胞数量、反应器内葡萄糖的日耗量,观察不同组内材料上细胞增殖与分布的情况；通过检测各组细胞ALP的活性和成骨基因Col-Ⅰ、OCN、OPN的表达,观察不同培养方式对材料上BMSCs分化的影响。结果1.灌注式生物反应器的构建与性能测试灌注式生物反应器系统经连续14d试运行,机械性能稳定,密闭性良好,流量稳定,未出现任何异常状况。当蠕动泵速率为10rpm时,系统内流体剪切应力大小为0.0895dyne/cm2 （8.95×10-3Pa）。材料细胞毒性学检测和细菌学检测结果表明：在严格无菌操作和遵守本系统操作规程的前提下使用本反应器系统是安全的。扫描电镜和荧光显微镜下观察：实验组材料上细胞分布的均一性与细胞数量均优于对照组。实验组材料内部与周缘均可见细胞分布,而对照组细胞主要聚集在材料的边缘部位。随着培养时间的延长,实验组细胞在材料内部大量增殖；而对照组细胞主要在边缘孔隙内增殖,材料内部细胞数量少,形态不佳,孔隙边缘偶可见未洗脱的死细胞。细胞活力测定：两组细胞活力均随着培养时间的延长而增大（P<0.05）。实验组灌注培养3、7、14 d时细胞活力分别为1.87±0.38,5.11±0.75,7.64±1.01；对照组静止培养3、7、14 d时细胞活力分别为1.42±0.13,2.55±0.88,3.86±0.73。培养3d时,两组细胞活力的差异无统计学意义（t=1.917,P>0.05）。培养7d（t=3.838，P<0.05）、14d（t=5.259,P<0.01）时灌注培养组细胞活力均高于同时间点的静止培养组,差异具有统计学意义。2.SD大鼠BMSCs的分离、培养与鉴定使用全骨髓贴壁培养法成功分离出SD大鼠的BMSCs,原代培养的SD大鼠BMSCs3代以后贴壁呈典型性漩涡状排列生长。经流式细胞仪鉴定细胞阳性表面标志物细胞占所检细胞比例分别为：CD29 99.86%,CD44 98.99%,CD9099.49%；BMSCs阴性表面标志物细胞占所检细胞比例分别为：CD451.26%,CD342.16%,CD1061.75%。证实分离培养的细胞为BMSCs细胞,纯度高。第3代细胞成骨诱导7d碱性磷酸酶染色阳性；成骨诱导28d茜素红染色阳性；成软骨诱导10d甲苯胺兰染色阳性,成软骨诱导21d阿尔新蓝染色阳性；成脂诱导21d油红O染色阳性。证实分离培养的BMSCs具有多向分化的潜能。3.两种灌注培养方式对大鼠BMSCs在大段材料上分布、增殖与分化的影响扫描电镜观察：培养14d,实验B组材料内部细胞生长密度优于实验A组。培养28d时,可见实验A组细胞形态发生了改变,细胞胞体增大,突起较多,呈多角形,与成骨细胞形态有一定程度的吻合。各时间点,两实验组材料内部细胞密度均高于对照组。葡萄糖日耗量测定结果显示：各组培养过程中各时间点葡萄糖日耗量均有显著性差异（P<0.001）；各组在培养的第3d,葡萄糖日耗量为最小值,以后随时间呈显著升高趋势。对照组与实验B组培养至15d左右时葡萄糖日耗量进入平台期,而实验A组则在20d左右时进入平台期。各时间点,两实验组葡萄糖日耗量均高于对照组,差异具有统计学意义（P<0.01）,培养至28d时,实验A组和实验B组的葡萄糖日耗量分别是对照组的3.7倍和4倍。培养至20d后,两实验组葡萄糖日耗量差异无统计学意义（P>0.05）。材料上细胞数量的测定：对照组在各时间点,材料各部位细胞数量的差异均有统计学意义（P<0.05）,各时间点材料底部（部位D）的细胞数量均多于中间部位（P<0.01）。实验A组第7、28d时各部位细胞数量差异无统计学意义（P>0.05）,14d时各部位细胞数量差异有统计学意义（P<0.01）,LSD法显示细胞数量,底部>顶部>中下部>中上部（D>A>C>B）。实验B组在各时间点,材料不同部位细胞数量的差异均无统计学意义（P>0.05）。细胞ALP活性测定：三组ALP活性均随着时间变化持续升高,对照组ALP活性21 d较14 d略有下降。各时间点,两实验组ALP活性均高于对照组（P<0.05）。7d时,实验A组ALP活性高于实验B组（P<0.05）；14d、21d时两实验组ALP活性差异无统计学意义（P>0.05）。成骨基因Col-Ⅰ、OCN、OPN的表达：随着培养时间的延长,三基因在各组细胞内均有不同程度的表达上调。两实验组在各时间点,各基因表达上调的倍数均较对照组高。第3d时,实验A组除OCN外（P>0.05）,OPN、Col-I mRNA表达倍数均高于实验B组（P<0.05）。第7d时,实验A组的OCN mRNA表达的倍数高于实验B组（P<0.05）,而OPN与Col-Ⅰ表达倍数的差异无统计学意义（P>0.05）。第14 d时,两实验组3个基因mRNA表达倍数的差异均无统计学意义（P>0.05）。结论1.本课题设计的灌注式生物反应器操作简便,性能稳定,灌注效果确切；对比静止培养法,体外构建大段组织工程骨时细胞增殖优势明显。2.全骨髓贴壁培养法原代培养SD大鼠BMSCs效率快,纯度高。3.该灌注式生物反应器能改善细胞在大段材料上的分布,提高扩增效率,促进BMSCs早期向成骨方向分化；间断灌注培养对比持续灌注培养,扩增效率更高,14d后BMSCs的ALP活性及成骨基因Col-Ⅰ、OCN、OPN的表达倍数无统计学差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 灌注式生物反应器的构建与性能测试
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第二部分 SD大鼠BMSCs的分离、培养与鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三部分 两种灌注培养方式对大鼠BMSCs在大段材料上分布、增殖与分化的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 全文总结
• 本研究的不足之处及展望
• 缩略语词汇表
• 硕士期间发表论文及成果
• 致谢
• 统计学审稿证明