真菌侵染诱导沉香形成关键技术效果评价及结香机制初步研究

论文摘要

沉香是瑞香科植物白木香（Aquilaria sinensis （Lour.）Gilg）含树脂的木材,是我国、印度及其他东南亚国家的传统名贵中药,具有行气止痛、纳气平喘、温中止呕的功效。同时,其具有浓郁而独特的香气,故常被用来制造高级香水、高级香皂、高级香精等。白木香是国产沉香的唯一植物资源,其树干在受到损伤或刺激的情况下才能分泌沉香树脂,但这需要十几年甚至几十年的累积。天然沉香的偶然性及长周期性已远不能满足市场需求,人们便开始使用各种人工促香方法促进白木香结香并且从未间断对沉香形成机制的探索。黑色树脂形成于沉香属植物的心材部位,为了找出含有树脂的木材需要砍倒树干,导致大量白木香树遭人为砍伐。白木香本身因木材松软既没有药用价值也无法当建材用,砍伐的白木香树及其叶、果皮、种子等均被作为废物处理。本实验对白木香叶、果皮、种子以及结香部位的化学成分进行了全面分析,在白木香果皮中首次检出大量沉香的特征性成分:芳香族化合物、倍半萜类和色酮类,发现白木香果皮提取物表现出良好的抗肿瘤活性。这为全面合理开发利用白木香植物资源奠定了研究基础。虽然白木香结香机制尚未明确,但普遍认为与其内生真菌有着密切关系。本课题组使用新的“生物法”—无创伤的“小孔滴注法”。无创伤方法既可排除白木香树干组织受到大面积的物理伤害,又能避免外源环境微生物对树干组织的侵染,从而保障了真菌对沉香诱导作用研究结果的可靠性。为了使“小孔滴注法”人工接种沉香既能实现快速结香又能让其品质达到药典的要求,运用GC-MS分析技术和分子生物学技术研究白木香结香过程中化学成分和结香前后内生真菌群落构成的动态变化,得出一定的动态变化规律并筛选出可快速诱导沉香形成的优势菌株;同时,建立了测定沉香中苄基丙酮含量的气相色谱法,为沉香质量全面评价体系奠定基础。镰刀菌属于子囊菌亚门,它是大部分白木香分离培养研究中均获得的常见内生真菌,我们也从白木香中分离到了,因此选择镰刀菌进行人工造香试验。建立了“小孔滴注法”人工造香21个月白木香叶内生真菌rDNA ITS区克隆文库,共获得28条序列,分属刺盘孢属、拟盘多毛孢属、拟茎点霉菌、球座菌属、曲霉属、核盘霉属、子囊菌等。其中刺盘孢属、拟盘多毛孢属、拟茎点霉菌为较优势菌,分别占文库的35.7%、10.7%、7.14%。而健康白木香（未结香）叶内生真菌rDNA ITS区克隆文库,得到10条序列,分属刺盘孢属、球腔菌属、枝氯霉属等。二者均具有的内生真菌群落只有刺盘孢属（Collectrotrichum）,说明白木香人工结香前后内生真菌群落构成差异较大。在白木香树内接种镰刀菌（Fusarium sp.）后,可能改变其内生真菌的微生态环境,从而导致其内生真菌群落构成发生变化。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 引言
• 1.1 沉香（白木香）化学成分的研究进展
• 1.1.1 沉香化学成分的研究
• 1.1.2 白木香叶化学成分分析
• 1.1.3 白木香种子、果皮、花和果实的化学成分分析
• 1.2 沉香（白木香）化学成分的药理活性的研究
• 1.3 沉香的形成与人工造香方法的研究进展
• 1.4 白木香内生真菌研究进展
• 1.5 沉香的结香机制研究进展
• 1.5.1 真菌侵染诱导白木香结香
• 1.5.2 物理、化学伤害诱导白木香结香
• 1.5.3 激发子诱导白木香悬浮细胞结香
• 1.5.4 “白木香防御反应结香假说”
• 1.6 本研究的目的和意义
• 第二章 白木香不同组织部位化学成分对比及活性初步筛选
• 2.1 不同组织年龄的白木香叶挥发性成分的研究
• 2.1.1 材料与仪器
• 2.1.2 方法
• 2.1.3 结果与分析
• 2.1.4 讨论
• 2.2 白木香果皮挥发性成分的研究
• 2.2.1 材料与仪器
• 2.2.2 方法
• 2.2.3 结果与分析
• 2.2.4 讨论
• 2.3 白木香种子挥发性成分的研究
• 2.3.1 材料与仪器
• 2.3.2 方法
• 2.3.3 结果与分析
• 2.3.4 讨论
• 2.4 “小孔滴注法”人工接种沉香的化学成分分析
• 2.4.1 材料与仪器
• 2.4.2 方法
• 2.4.3 结果与分析
• 2.4.4 讨论
• 2.5 白木香果皮抗肿瘤活性的初步筛选
• 2.5.1 材料
• 2.5.2 方法
• 2.5.3 抗肿瘤活性测定结果
• 2.5.4 讨论
• 第三章 沉香质量评价体系的建立
• 3.1 醇溶性浸出物含量测定
• 3.2 显色反应
• 3.3 薄层色谱鉴别
• 3.4 沉香中苄基丙酮含量测定
• 3.4.1 仪器与试药
• 3.4.2 色谱条件与系统适用性
• 3.4.3 理化鉴别
• 3.4.4 方法
• 3.4.5 结果与讨论
• 第四章 沉香结香过程中真菌作用效果及化学成分动态变化研究
• 4.1 “小孔滴注法”人工造香白木香结香关键技术
• 4.1.1 接种植株的选择
• 4.1.2 接种菌株的选择
• 4.1.3 “小孔滴注法”人工造香方法的建立
• 4.2 结香过程中浸出物/显色反应动态变化研究
• 4.3 GC-MS 分析白木香结香过程中叶的化学成分变化
• 4.3.1 材料与仪器
• 4.3.2 方法
• 4.3.3 结果与分析
• 4.3.4 讨论
• 4.3.5 结论
• 4.4 GC-MS 分析人工接种白木香结香过程中的化学成分变化
• 4.4.1 样品来源
• 4.4.2 方法
• 4.4.3 结果与讨论
• 第五章 沉香结香前后内生真菌群落构成的变化
• 5.1 材料与试剂
• 5.1.1 实验材料及样品采集
• 5.1.2 主要酶和试剂
• 5.1.3 菌株及培养基
• 5.1.4 克隆载体
• 5.1.5 引物
• 5.1.6 主要仪器
• 5.2 方法
• 5.2.1 样品的表面消毒
• 5.2.2 白木香茎、叶和结香部位组织石蜡切片的制备
• 5.2.3 总DNA 的提取（改良CTAB 法）
• 5.2.4 rDNA ITS 区的PCR 扩增
• 5.2.5 PCR 产物的割胶纯化
• 5.2.6 分子克隆与文库构建
• 5.2.7 重组质粒的筛选
• 5.2.8 重组质粒DNA 的提取纯化及目的克隆的序列测定
• 5.2.9 序列的分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 苯胺蓝染色光镜观察法观察白木香茎、叶和结香部位中内生真菌的分布
• 5.3.2 “小孔滴注法”人工造香21 个月白木香叶内生真菌rDNA ITS 文库构建及筛选
• 5.4 讨论
• 5.4.1 “小孔滴注法”接种 Fusarium sp.21 个月后白木香叶内生真菌的群落构成
• 5.4.2 已结香白木香叶“4Y-21”文库与健康未结香白木香叶HY 文库的群落构成比较
• 第六章 小结与展望
• 6.1 小结
• 6.1.1 白木香不同组织部位化学成分对比及活性初步研究
• 6.1.2 沉香质量评价体系的建立
• 6.1.3 人工造香过程中白木香化学成分动态变化研究
• 6.1.4 沉香结香前后内生真菌群落结构的变化
• 6.2 展望
• 参考文献
• 附表A 不同组织年龄白木香叶挥发性成分分析
• 附表B 人工接种白木香叶化学成分分析
• 附图 挥发性成分总离子流图
• 攻读硕士期间发表的论文
• 致谢