小鼠蛋白磷酸酶PP2A-Aα基因启动子的克隆和功能分析

论文摘要

蛋白磷酸酶PP2A是主要的丝氨酸/苏氨酸特异性磷酸酶,在真核生物中占到50%以上丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性。蛋白磷酸酶PP2A的全酶由3个亚基构成:结构亚基A,催化亚基C和调节亚基B。结构亚基以2种异构体形式存在即PP2A-Aα亚基和PP2A-Aβ亚基。结构亚基A为催化亚基C和调节亚基B提供了结合的支架和平台,因此在PP2A发挥活性时起着非常重要的作用。PP2A-Aα和PP2A-Aβ基因发生突变会导致人类的多种疾病,如癌症等。目前关于PP2A-Aα和PP2A-Aβ基因是如何被细胞内和细胞外因子调控的还知之甚少。在本研究中我们克隆了小鼠PP2A-Aα基因的启动子,构建了一系列从5′端删除部分序列的突变体和定点突变转录因子Ets-1,CREB,AP-2α和Sp1结合位点的突变体,并用这些质粒转染ARPE-19和FHL124细胞后用双荧光报告基因系统检测了其各自的相对荧光素酶的活性。我们的实验结果表明:（1）转录因子Ets-1,CREB,AP-2α和Sp1在ARPE-19和FHL124细胞系中都有表达;（2）小鼠PP2A-Aα基因的启动子无TATA框但有CAAT框,其活性区域主要在-625到+52区;（3）将与转录因子Ets-1所结合的序列突变后,其相对荧光素酶活性大大下降,约为野生型核心启动子A5荧光素酶活性的40%;（4）将与转录因子CREB所结合的序列突变后,其相对荧光素酶活性亦大大下降,约为野生型核心启动子A5荧光素酶活性的50%;（5）将与转录因子AP-2α所结合的2个位点的序列都突变后,其相对荧光素酶活性亦下降,约为野生型核心启动子A5荧光素酶活性的80%;（6）将与转录因子Sp1所结合的序列突变后,其相对荧光素酶活性增强,约为野生型核心启动子A5荧光素酶活性的120%。（7）转录因子Ets-1,CREB,AP-2α和Sp1的剂量依赖型荧光素酶的实验结果也显示:随着转入表达Ets-1,CREB,AP-2α蛋白的质粒的增加,PP2A-Aα核心启动子活性得到增强;随着转入表达Sp1蛋白的质粒的增加,小鼠PP2A-Aα核心启动子活性减弱。这进一步说明转录因子Ets-1,CREB和AP-2α能正向调节小鼠PP2A-Aα基因的表达,转录因子Sp1能负向调节PP2A-Aα基因的表达。（8）凝胶迁移滞后（EMSA）实验结果证实转录因子Ets-1,CREB,AP-2α和Sp1在体外都能结合到小鼠PP2A-Aα基因的启动子上的相应序列;（9）染色质免疫沉降（ChIP）的实验结果在活体细胞中证实了转录因子Ets-1和CREB能结合到小鼠PP2A-Aα基因的启动子上。总之,我们的研究结果显示多个转录因子共同调节着小鼠PP2A-Aα基因的表达。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 1.1 基因表达与蛋白可逆磷酸化
• 1.2 真核生物的蛋白激酶与蛋白磷酸酶
• 1.2.1 蛋白激酶的重要性及其分类
• 1.2.2 蛋白磷酸酶
• 1.3 真核生物基因表达调控及转录因子参与调控简介
• 1.3.1 真核生物基因表达调控
• 1.3.2 转录因子参与基因表达调控
• 第二章 实验部分之材料与方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 试剂与仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 小鼠基因组DNA（genomic DNA）的提取
• 2.2.2 小鼠PP2A-Aα基因启动子的克隆
• 2.2.3 小鼠PP2A-Aα基因启动子删除突变质粒的构建
• 2.2.4 PCR产物的克隆及序列分析
• 2.2.5 小鼠PP2A-Aα基因启动子体外定点突变质粒的构建
• 2.2.6 转染用高纯质粒的提取及其浓度的测定
• 2.2.7 WESTERN BLOT技术检测ARPE-19和FHL124细胞系中ETS-1,CREB,AP-2α和SP1的表达水平
• 2.2.8 ARPE-19和FHL124细胞的培养及其共转染分析
• 2.2.9 小鼠PP2A-Aα基因核心启动子A5活性与转录因子ETS-1,CREB,AP-2A或SP1剂量的关系
• 2.2.10 用双荧光素酶试剂盒检测细胞转染后其荧光素酶的活性
• 2.2.11 ARPE和FHL124细胞核蛋白的提取
• 2.2.12 凝胶迁移滞后方法分析ARPE-19和FHL124核蛋白中各转录因子与PP2A-Aα基因启动子序列的体外相互作用
• 2.2.13 染色质免疫沉降法分析转录因子ETS-1,CREB与小鼠PP2A-AA基因启动子序列的体内结合情况
• 第三章 实验结果
• 3.1 小鼠PP2A-Aα基因启动子的克隆
• 3.2 小鼠PP2A-Aα基因启动子序列的初步分析及从5′端删除部分序列质粒的构建
• 3.3 用高纯质粒A1,A2,A3,A4,A5和A6转染ARPE-19细胞及双荧光报告基因系统定义PP2A-Aα基础启动子与核心启动子区
• 3.4 PP2A-Aα核心启动子中多个顺式作用元件的软件预测结果
• 3.5 WESTERN BLOT结果证实多个转录因子在不同的视觉细胞ARPE-19和FHL124细胞系中都有表达
• 3.6 小鼠PP2A-Aα基因核心启动子A5与突变转录因子ETS-1,CREB,AP-2α或SP1结合序列后其相对荧光素酶活性
• 3.7 小鼠PP2A-Aα基因核心启动子A5活性与转录因子ETS-1,CREB,AP-2α或SP1不同剂量间的关系
• 3.8 凝胶迁移滞后实验检测转录因子ETS-1,CREB,AP-2A或SP1在体外与小鼠PP2A-Aα基因启动子序列的结合
• 3.9 染色质免疫沉降分析证实ETS-1和CREB在体内能结合到PP2A-A基因的启动子上
• 第四章 讨论
• 4.1 蛋白磷酸酶2A（PP2A）是一个三聚体蛋白复合物
• 4.2 蛋白磷酸酶2A（PROTEIN PHOSPHATASE 2A,PP2A）的重要作用
• 4.2.1 PP2A参与Rb蛋白家族的活性调节
• 4.2.2 PP2A在Wnt信号通路中的作用
• 4.2.3 PP2A在MAP激酶通路中的作用
• 4.2.4 PP2A在肿瘤发生中的作用
• 4.2.5 PP2A在细胞凋亡中的作用
• 4.3 PP2AA（PR65/A）亚基突变导致人的多种肿瘤发生
• 4.4 转录因子ETS-1及其在调节小鼠PP2A-Aα基因表达中的作用
• 4.5 转录因子CREB在调节PP2A-Aα基因表达中亦起着非常重要的作用
• 4.6 转录因子AP-2α也参与PP2A-Aα基因表达的调控
• 4.7 转录因子SP1负向调节PP2A-Aα基因的表达
• 第五章 研究总结与展望
• 参考文献
• 博士学习期间撰写、发表的主要论文
• 致谢