黑盖木层孔菌多糖化学结构和生物活性研究

论文摘要

本论文主要通过生物发酵技术培养黑盖木层孔菌;确定最优培养基;并且从菌丝体和发酵液中提取、纯化得到水溶性多糖;研究多糖的化学结构及抗肿瘤和免疫活性,并探讨多糖的结构与生物活性之间的关系。首先筛选了适宜黑盖木层孔菌菌丝体生长的碳源和氮源。最优碳源为可溶性淀粉,最优氮源为玉米面,菌丝的生长速度在有机氮源培养基上要明显优于无机氮源,确定蔗糖-玉米面为黑盖木层孔菌的最佳碳-氮源组合。并且,该菌种适宜液体发酵培养。黑盖木层孔菌经发酵培养后,得到发酵菌丝体,确定菌丝体多糖的最优提取条件为:提取温度100℃,浸提4次,每次2小时,浸提比1:30,各因素影响的大小次序是:提取次数>浸提比>浸提时间。分别从菌丝体和发酵液中分离得到水溶性粗多糖:菌丝体粗多糖PNW和胞外粗多糖PNM。GC分析粗多糖组成:PNW由甘露糖和葡萄糖构成,摩尔比为2.68:1.00;PNM由甘露糖、半乳糖和葡萄糖构成,摩尔比为2.02:1.00:3.21。采用冻融分级、脱蛋白、离子交换层析和分子筛凝胶层析等方法,分别从PNW和PNM中纯化出多糖PNW1和PNM1。HPLC检验PNW1和PNM1均为单一峰,平均分子量分别为33 kDa和29 kDa。GC分析,PNW1和PNM1均为杂多糖,由葡萄糖、半乳糖、甘露糖及少量的阿拉伯糖和岩藻糖组成,其摩尔比分别为3.26:8.77:6.44:1.00:1.35和20.06:8.72:6.94:1.00:0.76。采用部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化等化学分析方法及IR、GC、GC-MS、13C NMR等仪器分析方法对PNW1和PNM1进行结构分析。确定了PNW1和PNM1的结构重复单元。PNW1的基本结构为:1→6- Glc和1→6- Gal构成主链,从Glc和Gal的O-2连接侧链,侧链由1→6- Man短链和Ara、Fuc、Man的末端构成。PNM1的基本结构为:1→6- Glc和1→6-Gal构成主链, Glc的O-2连接侧链,侧链由1→6- Man短链和Ara、Fuc、Glc、Man的末端构成。建立BALB/c小鼠体内S- 180实体瘤模型,进行体内抗肿瘤活性试验。经测定,菌丝体多糖和胞外多糖均能抑制小鼠体内移植性肿瘤S- 180的生长。并且,菌丝体多糖%的抗肿瘤活性优于胞外多糖。其中PNW1在400 mg/kg时抑瘤率最高,达到74.70%。在体外实验中,菌丝体多糖和胞外多糖对S- 180细胞没有的明显抑制作用。菌丝体多糖和胞外多糖均有免疫调节功能,能增加荷瘤小鼠的脾相关系数和胸腺相关系数,调节血清中的肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的含量。多糖与脾淋巴细胞或巨噬细胞共培养后,表现出增强淋巴细胞的增殖和腹腔巨噬细胞的吞噬作用,并且促进巨噬细胞分泌NO和TNF-α。推测,其抗肿瘤作用是通过调节宿主的免疫机能实现的,可能与巨噬细胞有关。PNW1和PNM1的分子量相近,在30 kDa左右,均由葡萄糖、半乳糖、甘露糖及少量的阿拉伯糖和岩藻糖组成,各单糖的含量不同,结构也不同,但是他们的结构有共同的特点:主链是由1→6- Glc和1→6- Gal共同构成,由O-2连接侧链,侧链残基为1→6- Man短链。推测,分子量不高的带有O-2分支点的1→6真菌杂多糖具有抗肿瘤和免疫活性。比较两种多糖的活性,PNW1的抗肿瘤活性明显优于PNM1,免疫活性也优于PNM1,表明真菌多糖的抗肿瘤活性也与糖苷键的类型及其位置有关。

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摘要

Abstract

第一章前言

1.1 真菌多糖概述

1.1.1 真菌的发酵生产进展

1.1.2 真菌多糖生物活性

1.1.3 真菌多糖的化学结构

1.1.4 真菌多糖结构与活性关系

1.2 真菌多糖的研究方法概述

1.2.1 真菌多糖的提取和纯化

1.2.2 真菌多糖的结构研究

1.3 本课题研究的目的和意义

参考文献

第二章黑盖木层孔菌发酵条件的研究

2.1 引言

2.2 实验部分

2.2.1 供试菌株

2.2.2 母种培养基

2.2.3 母种的分离

2.2.4 培养基的筛选

2.2.5 液体发酵培养及不同代数菌丝体多糖的分析

2.3 结果和讨论

2.3.1 不同碳源对黑盖木层孔菌菌丝生长的影响

2.3.2 不同氮源对黑盖木层孔菌菌丝生长的影响

2.3.3 最佳碳氮源组合的筛选

2.3.4 不同代数菌丝体多糖的分析

2.4 结论

参考文献

第三章黑盖木层孔菌多糖的分离提取和纯化

3.1 引言

3.2 实验部分

3.2.1 试剂

3.2.2 菌丝体多糖的提取及提取条件的优化

3.2.3 胞外多糖的提取

3.2.4 多糖的纯化

3.2.5 多糖的理化性质研究

3.3 结果和讨论

3.3.1 菌丝体多糖提取条件的优化试验

3.3.2 胞外多糖的提取

3.3.3 粗多糖的特征

3.3.4 多糖的纯化

3.3.5 PNW1 和PNM1 理化性质研究

3.4 结论

参考文献

第四章黑盖木层孔菌多糖的结构研究

4.1 引言

4.2 实验部分

4.2.1 试剂和仪器

4.2.2 碘反应实验

4.2.3 红外光谱分析

4.2.4 部分酸水解

4.2.5 高碘酸氧化和Smith 降解

4.2.6 甲基化分析

13NMR'>4.2.7 C¹³NMR

4.3 结果和讨论

4.3.1 红外光谱分析

4.3.2 PNW1 的结构分析

4.3.3 PNM1 的结构分析

4.4 结论

参考文献

第五章黑盖木层孔菌多糖的生物活性测定

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 材料和试剂

5.2.2 抗肿瘤研究

5.2.3 免疫活性测定

5.2.4 统计方法

5.3 结果和讨论

5.3.1 多糖的抗肿瘤活性

5.3.2 多糖对淋巴细胞转化功能的影响

5.3.3 多糖对Mφ功能的影响

5.4 结论

参考文献

论文总结

致谢

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