以玉米幼胚为受体转化海藻糖合成酶基因

论文摘要

干旱是玉米生产的主要限制因素之一。玉米自身的水分生理状况也决定了它比其他禾本科作物更易受干旱危害。尽管玉米不同基因型间存在一定的耐旱性差异,但耐旱性受微效多基因控制,遗传机制复杂,传统的遗传改良难度较大。因此,借助转基因方法,将外源耐旱基因转入玉米,可能是有效提高玉米耐旱能力的快捷方法。近年来耐旱基因研究取得了较快进展,相继克隆了一些重要的耐旱基因,试图提高其耐旱性,但因这些基因耐旱能力不够强,耐旱机制与玉米生理代谢不协调等原因,转基因后代的耐旱性不能达到玉米生产要求(宋松泉等,2000;王关林等,2002;宋凤斌等,2005)。因此需要探索利用耐旱能力更高,适宜玉米生理代谢机制与生产要求的耐旱基因,海藻糖合成酶基因TPS1就是其中之一。TPS1合成的海藻糖在干旱条件下通过氢键与氨基酸相连,可以代替水起到防止蛋白质变性和细胞融合的作用(Crowe等,1992)。如果利用海藻糖的抗逆耐旱特性,采用基因工程将其相关酶的基因转入玉米等作物,进而培育耐旱抗逆新品种,这对于植物遗传改良具有重要意义。常用的玉米转基因方法多以胚性愈伤组织作为外源基因受体,而胚性愈伤组织的诱导和分化再生,严重受到基因型的限制,只有极少数材料能稳定高效诱导胚性愈伤组织,加之胚性愈伤组织培养时间长,操作繁琐,分化再生率不高等原因,严重制约了玉米转基因研究的进展。因此,有必要开展其他转基因方法研究,以提高转化效率。为此,本试验开展了以玉米幼胚为受体、用农杆菌介导法将酿酒酵母海藻糖合成酶基因TPS1转化玉米的研究,结果如下:1)以幼胚为受体转化外源基因,可缩短转化过程。以幼胚为转化受体,与含外源基因的农杆菌共培养后,不经过愈伤组织诱导和筛选,直接再生植株,减少基因型对愈伤组织为受体的转基因限制,避开组织培养的繁锁过程,缩短转化程序。2)以幼胚为受体转化外源基因的优化体系。由于幼胚对农杆菌浸染更敏感,尤其是褐化率比愈伤组织更高,造成转基因失败,为此试验通过对幼胚大小和抗褐化剂半胱氨酸(Cys)的浓度筛选,发现长度在1.5～2.0 mm的幼胚更适合农杆菌介导的幼胚转化,并且在农杆菌与幼胚的共培养阶段添加200 mg/L的半胱氨酸,能够有效降低幼胚在农杆菌浸染过程中的褐化率(29.3%),比对照褐化率(53.7%)减少约一倍。3)通过PCR检测,初步发现外源基因已转入受体。将转基因再生植株移栽后,生长至5叶期,每株取一小块叶片,按5株组成一个混合样,提取DNA,进行PCR特异扩增,有目的条带的再分单株检测,最后得到1株阳性转基因植株。按混样检测法可以提高阳性植株检测效率和准确性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1.文献综述
• 1.1 主要农作物转基因的研究进展
• 1.1.1 大豆转基因研究进展
• 1.1.2 水稻转基因研究进展
• 1.1.3 小麦转基因的研究进展
• 1.1.4 玉米转基因研究进展
• 1.2 农杆菌概述
• 1.2.1 农杆菌介导的遗传转化原理
• 1.2.2 农杆菌介导法的优点
• 1.3 转化体系对转化效率的影响
• 1.3.1 外植体对转化效率的影响
• 1.3.2 基本培养基及其附加物对转化效率的影响
• 1.3.3 筛选试剂对转化效率的影响
• 1.3.4 信号分子对转化效率的影响
• 1.3.5 共培养温度对转化效率的影响
• 1.3.6 侵染时间及浓度对转转化效率的影响
• 1.4 海藻糖概况
• 1.4.1 海藻糖的分布及其性质
• 1.4.2 海藻糖的生物活性
• 1.4.5 海藻糖的合成途径及其相关基因
• 1.4.6 海藻糖合成酶基因遗传转化的研究进展
• 1.5 本研究的方法和目的
• 2.材料和方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 细菌、质粒和引物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 抗生素和激素
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 检测载体
• 2.2.2 制备含载体pCWTPS1300的农杆菌
• 2.2.3 玉米材料的准备
• 2.2.4 玉米幼胚的转化及植株的再生
• 2.2.5 转基因植株DNA的提取
• 2.2.6 PCR分子检测
• 2.2.7 回收目的片段测序
• 3.结果与分析
• 3.1 检测PCWTPS1300质粒的表达结构
• 3.2 不同大小幼胚经农杆菌浸染后的褐化率分析
• 3.3 半胱氨酸含量对幼胚褐化的影响
• 3.4 转基因植株的PCR检测
• 4.讨论
• 4.1 玉米幼胚遗传转化体系的优化
• 4.1.1 遗传转化受体的特殊性
• 4.1.2 受体材料大小的选择
• 4.1.3 共培养中Cys浓度的确定
• 4.1.4 头孢霉素对受体的影响
• 4.1.5 不经筛选对转化效率的影响
• 4.1.6 转基因植株的检测
• 4.2 海藻糖合成酶基因在转基因中的应用前景
• 4.3 玉米转抗旱基因存在的问题及展望
• 参考文献
• 致谢