论文摘要
适应（adaptation）是生物体应对生存环境调整自身生理机制以适应环境而生存的过程,是对抗应激损伤的有效机制。应激状态下,机体通过神经内分泌系统的调节,多层次启动了复杂的细胞内调控网络,导致多种内源性物质产生,如腺苷、受体、细胞内信息传导因素、效应蛋白等,以维持机体内环境的相对稳定,修复分子损伤,减轻细胞损伤的发生,增强机体对外界不良因素的抗御能力,逐步建立了对外界应激源的适应能力。热休克蛋白（heat shock/stress proteins, HSPs）是机体应激时迅速大量表达的一组蛋白质,HSP70是HSP家族中最著名的成员,作为分子伴侣参与了新生肽链的折叠、转运和蛋白质的组装聚集及降解。更值得关注的是,HSP70可以通过阻抑细胞内重要蛋白质的变性和聚集,修复已变性失活的蛋白质,稳定细胞骨架、增强细胞内抗氧化能力、保护酶功能以抗御细胞损伤,是重要的损伤修复分子。本研究室前期工作发现,用预热应激方法诱导HSP70高表达能够明显减缓应激损伤,加速机体应激适应机制的建立;进一步的研究发现,HSP70的升高显著阻抑应激所致细胞凋亡途径。因此我们推测,HSP70是应激适应建立的重要功能蛋白质,HSP70与其所调节的多种功能蛋白质及其所参与的细胞分子修复机制构成了一种多系统多层次协调的应激损伤修复体系,为应激适应机制的建立提供了可能性和生物学基础。本研究通过认识HSP70在机体应激适应过程中表达规律的变化,确认其对应激适应的促进功能,发现HSP70在此过程中的相互作用蛋白质,阐明其生物学功能及其相互关系,不仅可以深刻揭示应激适应的生物学机制及其重要蛋白质基础,而且对于探索控制应激损伤,促进应激适应的医学措施具有十分重要的意义。一、HSP70在应激适应建立过程中的表达规律及其生物学功能采用间歇性温和束缚应激的方式诱导大鼠应激适应机制的建立,以机体在应激状态下神经内分泌变化和心肌的损伤程度作为确认大鼠应激适应机制建立的重要指标。结果表明,适应大鼠应激时,HPA轴反应趋于平缓,血浆糖皮质激素、儿茶酚胺分泌水平、LDH、CK-MB活性显著低于单纯应激组;Nagar olsen染色和电镜检查可见:适应大鼠应激时心肌损伤明显低于单纯应激组,表明应激适应动物模型已经建立。同时,模拟适应机体糖皮质激素水平变化,采用低浓度糖皮质激素预处理心肌细胞株,发现其可以降低高浓度糖皮质激素对心肌细胞的损伤作用,表明低浓度糖皮质激素预处理可以诱导心肌细胞应激适应的建立。采用蛋白质免疫印迹技术观察应激适应大鼠心肌组织中HSP70表达水平。结果显示,间歇性温和应激诱导心肌组织HSP70表达水平显著升高,并在适应诱导过程中持续高水平表达,在HSP70表达水平升高的应激适应状态下,适应大鼠应激时心肌损伤明显低于单纯应激组。离体细胞研究发现,低浓度糖皮质激素预处理亦可导致心肌细胞HSP70明显升高。调控心肌细胞中HSP70的表达,可见高表达HSP70对糖皮质激素导致的心肌细胞损伤具有明显的抑制作用,而抑制HSP70表达可显著增强糖皮质激素导致的心肌细胞损伤。表明HSP70在应激适应建立中具有重要的生物学功能。二、应激适应建立过程中HSP70相互作用蛋白质的筛选采用生物信息学分析发现了43个与HSP70具有相互作用的蛋白质,包括HSP70协同伴侣分子:HSF1、HSPBP1、BAG1、BAG2、BAG3、BAG4、HIP、HSP40、CHIP、HOP、DNAJA3、DNAJB11、TTC1;凋亡通路相关蛋白质:PDCD8、FANCC、IKBKG、TP53、APAF1、BCL2、HCFC1、RHOA等;细胞周期调节相关蛋白质:APEX1、MAP3K5、PPP1R15A、CDK9、EIF2AK1、NR3C1、EIF2AK2、APOB、PKC等;细胞分化调控蛋白质:MSR1、PTMA、TIF1、KRT7等;胚胎发育相关蛋白质:SOX9、PEX5等;蛋白质的翻译转运相关蛋白质:BAT3、TCERG1、TID1、TOM7等;以及能量代谢调节蛋白质:NQO1、SLC5A1等。采用酵母双杂交方法,以HSP70为诱饵蛋白筛选与HSP70具有相互作用的蛋白质,发现HIP与HSP70存在相互作用。免疫共沉淀结果不仅确认应激适应过程中HIP和HSP70相互作用的存在,而且显示随着应激适应诱导时程的延长及应激适应机制的建立,HIP与HSP70相互作用复合物逐渐增多,提示了HIP和HSP70的相互作用在应激适应建立过程中可能具有重要作用。三、HSP70相互作用蛋白质HIP在应激适应建立过程中的生物学功能采用蛋白质免疫印迹技术观察应激适应大鼠心肌组织HIP的表达变化,结果显示:应激适应可诱导HIP表达水平显著升高,且在适应诱导过程中持续高水平表达。以心肌细胞株H9C2建立细胞应激适应模型,HIP在应激适应诱导建立过程中持续升高。调控心肌细胞株中HIP表达水平,可见高表达HIP对糖皮质激素导致的心肌细胞损伤具有明显的抑制作用,而抑制HIP表达可导致心肌细胞损伤明显增强;表明HIP在应激适应建立中亦具有重要的生物学功能。对HIP和HSP70在H9C2细胞中表达水平实现共同调控,观察其对应激细胞的保护作用。实验结果显示,应激适应建立过程中HIP生物学功能的实现依赖于HSP70的存在;抑制HSP70表达,或使HIP与HSP70相互作用结构域缺失不能与HSP70结合,则使HIP失去对应激心肌细胞的保护作用。应用荧光素酶报告基因系统的初步研究结果显示,HIP与HSP70阻抑应激心肌细胞损伤可能是通过降低糖皮质激素的转录激活活性实现的。综上所述,HSP70在应激适应建立过程中具有重要的生物学功能;HIP是应激适应过程中心肌细胞内与HSP70相互作用的重要蛋白质,其可通过HSP70的介导,降低糖皮质激素受体的转录激活活性,实现对应激机体心肌细胞的保护作用,促进应激适应机制的建立。