先天性巨细胞病毒感染致脑发育异常及其机制研究

论文摘要

【研究背景】人巨细胞病毒（HCMV）是导致胎儿中枢神经系统（CNS）损害的首要病因，严重影响儿童生存质量，揭示其神经损伤机制，对防治策略的制定和全面提高人口素质具有重大社会和经济意义。但其发病机制研究成效甚微，原因在于：①巨细胞病毒（CMV）具严格种属特异性，不能建立HCMV感染的动物模型；②CMV是最大的DNA病毒和蛋白嵌合体，其基因动态表达，蛋白种类多、功能复杂；③CMV宫内感染致脑发育异常与发育阶段性密切相关，如何在动态发育的过程中抓住关键时空进行研究也是难点问题。小鼠巨细胞病毒（MCMV）与HCMV具相似生物学特性，其先天性感染的CNS病理表现亦与人相似，且不存在伦理问题，因而成为模拟研究HCMV宫内感染神经损害机制的有效工具。CMV感染所致CNS损伤主要见于胎儿期，既往认为胎儿免疫系统不成熟，不能保护脑组织免受感染是其主要原因。但近年研究发现，CMV对发育中的脑组织有特殊亲嗜性，这与细胞的内在原因有关。因此，CMV感染所致CNS损伤是一种与脑发育有关的疾病，必须在CNS动态发育过程中研究其发病机制。【目的】建立适合整体水平研究CMV先天感染的小鼠模型，观察病毒对不同发育阶段胎脑发育的影响及其CNS损伤的病理特点。进一步利用神经干细胞（NSCs）和胚胎干细胞（ES cells）向神经细胞分化的细胞模型，在体外模拟神经细胞发育过程，在细胞和分子水平上动态研究CMV对ES、NSCs及不同发育阶段神经细胞功能和发育的影响，并探讨其中可能涉及的分子机制，为阐明CMV感染致脑发育异常机制奠定实验和理论基础，为寻找有效防治措施提供新策略。【方法】1 MCMV先天感染小鼠模型建立与整体研究在BALB／c孕鼠孕8d（E8d，孕中期，神经管开始形成）和孕13.5d（E13.5d，孕中后期，神经元形成高峰期），采用宫内注射法接种含有Lac Z报告基因的MCMV重组毒株RM461（104PFU、103PFU和102PFU），并以同期注射DMEM细胞培养基的孕鼠作为对照。于E18.5d剖宫取出胎鼠，通过X-gal染色和组织切片分析，观察MCMV接种时妊娠阶段和病毒载量对妊娠结局、胎鼠CNS发育和病理损伤特点的影响。2 MCMV对神经干细胞分化发育细胞模型的影响从E13.5d胎鼠脑组织中分离、培养和鉴定NSCs，建立NSCs向神经细胞分化发育的细胞模型；在MCMV RM461感染后，用X-gal染色监测感染过程，透射电镜观察超微结构改变和病毒颗粒，PCR检测受染细胞和培养上清中病毒DNA，并结合观察培养上清接种到小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）的细胞病变效应共同评估NSCs对MCMV的易感性和感染状态；采用细胞生长曲线和MTT实验，观察MCMV对NSCs增殖的影响；采用细胞免疫化学和流式细胞术分析Nestin、GFAP、NSE和NF-200表达，探讨MCMV对NSCs分化的影响；采用FITC-Annexin V+PI染色和流式细胞术分析病毒对NSCs凋亡的影响；采用Western blot联合RT-PCR法检测MCMV对NSCs分化相关基因Wnt-1和Ngn1表达的影响。3 MCMV对胚胎干细胞定向分化发育细胞模型的影响以小鼠ES细胞系D3为研究对象，在4-／4+方案诱导ES细胞定向生成神经元的基础上，利用ATRA联合星形胶质细胞高效诱导ES细胞定向生成神经干／前体细胞和神经元；通过形态学观察、畸胎瘤形成实验、碱性磷酸酶染色、RT-PCR检测胚胎干细胞标志Oct-4表达对ES细胞的全能性进行鉴定；用免疫组织化学结合流式细胞术检测ES细胞来源的NSCs的数量和纯度；用分化实验对所诱导的NSCs的分化潜能进行检测；最后利用ES细胞向神经细胞分化的细胞模型探讨MCMV对ES细胞及ES细胞向神经细胞分化的影响。【结果】1 MCMV先天感染模型建立与整体研究1)用宫内注射法成功建立MCMV先天感染小鼠模型：高病毒载量宫内感染极易导致死胎和吸收胎，仅少数胎鼠存活（5.9％）；低病毒载量感染组存活率明显提高（47.1％），但脑组织病毒阳性率随之下降（12.5％）。103PFU为建立MCMV先天感染模型的合适剂量，其存活率和脑组织病毒阳性率分别为27.8％和80％。2)采用103PFU病毒载量，E8d宫内注射MCMV组胎鼠的存活率（26.9％）和体重显著低于同期DMEM对照组，而吸收胎率（55.8％）高于对照组；E13.5d宫内注射MCMV组胎鼠存活率（52.0％）低于同期DMEM对照组，而吸收胎率（14.0％）与对照组无明显差异。E8d与E13.5d病毒注射组相比，前者存活率低于后者，而吸收胎率高于后者，且发现小头畸形鼠3例。3) MCMV感染胎鼠的脑、心、肝、脾、肺、肾等组织X-gal染色呈阳性反应，并且均可分离到病毒，说明该模型是一种全身播散型感染。脑组织X-gal染色显示阳性细胞主要位于脑室管膜下区、海马区和大脑皮层的外周部分。2 MCMV对神经干细胞分化发育的影响1)体外培养的NSCs可在体外连续传代，仍保持球形生长的能力，nestin表达强阳性，可进一步分化NSE、NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。2) MCMV感染NSCs可形成产毒性感染：在感染48h后，细胞出现肿胀，体积增大，神经球边缘的细胞发生脱落和死亡，细胞形态改变随病毒感染复数（MOI）的增加而更加明显；X-gal染色显示，24h受染细胞即可出现阳性改变，48h达高峰；病毒感染72h时，受染细胞及培养上清中MCMV DNA呈阳性，培养上清接种到小鼠MEF细胞后可出现明显细胞病变；电镜下受染细胞胞浆中存在病毒颗粒，细胞器肿胀明显。3) MCMV可明显抑制NSCs的增殖，抑制作用随MOI增加而增强。4)MCMV可明显抑制NSCs的分化：流式细胞仪检测发现，NSCs分化培养2d时感染组和未感染组nestin阳性细胞分别为（62.2±1.8）％和（37.2±2.4）％，差异有极显著性（P＜0.01）；而GFAP阳性细胞比率分别为（37.4±1.6）％和（50.3±1.8）％，NSE阳性细胞比率分别为（8.9±0.8）％和（23.4±1.3）％，差异均有极显著性（P＜0.01）。5)MCMV对NSCs细胞凋亡的影响：MCMV感染组与对照组的早期凋亡率和晚期凋亡率均无明显差异。但感染组细胞死亡率自感染48h始上升，明显高于对照组，至第5d可达（15.2±3.8）％，显著高于对照组的（5.1±0.3）％。6)MCMV感染可抑制Wnt-1和Ngn1的表达：RT-PCR检测发现，感染组Wnt-1基因表达量在12h，24h，48h时低于对照组（P＜0.01），Ngn1基因表达量在12h，24h，48h，72h时均低于对照组（P＜0.01）；Western blot分析发现，感染组Wnt-1蛋白表达量在24h，48h时低于对照组（P＜0.01）。3 MCMV对胚胎干细胞定向分化发育的影响1)体外培养的小鼠ES细胞-D3在胚胎成纤维饲养层细胞上连续传代培养，仍保持向三胚层分化的能力，在免疫缺陷鼠体内可形成畸胎瘤；ES细胞AKP染色和Oct-4表达阳性。2) ATRA可促进ES细胞向神经元方向分化：采用4-／4+方案诱导分化的NF-200阳性细胞为（27.3±1.2）％，而未加ATRA对照组（4-／4-）仅为（2.1±0.4）％（P＜0.01）。3) 2-／2+ATRA联合星形胶质细胞（基质诱导细胞）可高效诱导ES细胞分化为神经前体细胞和神经元，最终可诱导形成纯度高达91.4％的nestin阳性细胞；nestin阳性细胞在含血清培养基中可进一步分化为神经元、星形神经胶质细胞和少突胶质细胞，联合诱导组NF-200和NSE阳性率为（42.7±2.6）％，而2-／2+／4-ATRA对照组阳性率仅为（11.2±1.8）％（P＜0.01）。4) MCMV感染未分化的ES细胞不能形成产毒性感染，但分化的ES细胞可形成产毒性感染；MCMV感染不影响未分化ES细胞的增殖。5) MCMV感染可抑制ES细胞来源的神经元形成，感染组NF-200阳性细胞为（10.2±0.3）％，显著低于对照组的（29.3±0.8）％（P＜0.01）。【结论】1．成功建立了先天性MCMV感染的小鼠模型与NSCs和ES细胞向神经细胞分化的细胞模型，为体内、外探讨CMV先天感染致脑发育机制提供了较为切实可行的、理想的细胞和整体研究模型。2．MCMV先天感染可导致明显的脑发育异常；MCMV对妊娠结局的影响与病毒载量、感染的妊娠阶段有关，小鼠妊娠中期对MCMV的敏感性要高于晚期。3．MCMV可感染体外培养的NSCs，并能形成产毒性感染；MCMV可明显抑制NSCs的增殖、分化并可导致NSCs死亡；MCMV可通过抑制Wnt-1和Ngn1基因表达而影响NSCs分化；MCMV抑制NSCs的增殖与分化可能与先天性CMV感染致脑发育异常有关。4．星形胶质细胞不仅可提高ES来源的NSCs数量，还可促进NSCs向神经元方向分化，利用星形胶质细胞可改善诱导ES生成NSCs的培养体系，此模型可进一步用于体外动态研究神经细胞分化发育机制。5．MCMV不能使未分化的ES细胞形成产毒性感染，未分化的ES细胞对MCMV有一定的抵抗力；ES细胞在分化过程中可获得形成产毒性感染的能力；MCMV感染可抑制ES细胞来源的神经元形成。

论文目录

• 一 符号说明
• 二 中文摘要
• 三 英文摘要
• 四 前言
• 五 正文
• 第一部分 先天性巨细胞病毒感染小鼠模型建立与整体研究
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 照片
• 第二部分 小鼠巨细胞病毒对神经干细胞分化发育细胞模型的影响
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 照片
• 第三部分 小鼠巨细胞病毒对胚胎干细胞定向分化发育细胞模型的影响
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 照片
• 六 全文小结
• 七 参考文献
• 八 综述/专论
• 1 HCMV免疫逃避分子机制研究进展
• 2 抗病毒药物在儿科的应用
• 九 附录 小鼠胚胎发育与人类胚胎发育对照表
• 十 博士研究生期间发表论文及获奖励情况
• 十一 致谢