人Bcl-xL基因的克隆、表达及其修饰的骨髓基质干细胞用于兔关节软骨缺损修复的实验研究

论文摘要

骨性关节炎或关节创伤等造成的软骨损伤在中老年人群中十分常见,且致残率高,严重影响患者的生活质量。关节软骨自身修复能力十分有限,因此,关节软骨损伤通常会导致严重的关节软骨退变[1, 2]。关节软骨损伤的修复仍是临床医生面临的难题之一,目前尚未得到很好地解决。传统的治疗包括软骨下骨钻孔、微骨折等方法。这些方法在修复和重建关节软骨时仍存在一定的不足,例如自体骨软骨、骨膜或软骨膜移植会造成附加损伤,且其来源有限,异体组织的排异反应等问题尚未得到很好解决。近年来,组织工程学科的兴起与发展为关节软骨修复提供了新的选择。种子细胞及其来源问题仍是目前组织工程面临的最大挑战。骨髓基质干细胞近年来成为研究的热点,它是存在于骨髓基质内的非造血系细胞来源的亚群,具有较强的扩增能力,在一定的条件下可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞及神经细胞等分化,有望成为组织工程的较理想的种子细胞。但由于每个成人供体每次只能抽取10～20 ml骨髓,只能从中得到很少量的干细胞,据估算大约每105个基质支持细胞中只含有1个骨髓基质干细胞,而组织工程软骨的构建需要大量的种子细胞,这就必须经体外的大量扩增才能满足需要[3]。与此同时,在骨髓基质干细胞的培养、扩增过程中由于细胞凋亡,很大程度上限制了其作为种子细胞的应用。基因抗凋亡策略是种子细胞的体外大量扩增一种较好的选择[4]。Bcl-xL是细胞程序性凋亡调节基因家族Bcl-2基因蛋白家族的重要成员之一,研究表明Bcl-xL可通过多条途径来抑制各种凋亡诱导因素例如营养匮乏、辐射照射等引起的细胞凋亡的发生,较Bcl-2具有更好的抗凋亡作用。除了抗凋亡作用,Bcl-xL还具有一定的抗炎作用。将兼有抗凋亡和抗炎作用的Bcl-xL应用于骨髓基质干细胞,将为其在组织工程中的应用提供广阔的前景。本实验首先根据GenBank中人Bcl-xL基因序列,并针对拟使用的真核表达载体pcDNA3、pEGFP-N2分别设计引物,在上下游引物中分别引入XhoI和EcoRI酶切位点,扩增目的基因。利用酶切连接使目的基因正确插入真核表达载体,之后进行酶切鉴定和基因测序,证明成功构建了Bcl-xL真核细胞表达载体pcDNA3-Bcl-xL、pEGFP-N2-Bcl-xL。然后,我们利用脂质体转染的方法分别用重组载体pcDNA3-Bcl-xL、空载体pcDNA3转染骨髓基质干细胞,Western Blot、间接免疫荧光可观察到目的蛋白的表达。将基因转染的骨髓基质干细胞血清剥夺24小时后,流式细胞仪检测到实验组凋亡率较空载体及未转染组明显降低,表明Bcl-xL基因的表达对骨髓基质干细胞具有明显的抗凋亡作用,可有效保护骨髓基质干细胞免于因营养匮乏而引起的凋亡。RT-PCR方法检测到实验组中骨髓基质干细胞中相关基因mRNA表达水平亦有相应变化,可提高促进软骨生成的基因mRNA水平,同时降低了炎症相关因子基因的mRNA水平。随后,我们利用荧光真核表达载体转染骨髓基质干细胞,将转染后的骨髓基质干细胞与鼠尾胶原混悬后注射入已形成膝关节软骨缺损的实验用新西兰白兔的膝关节腔中,2周后取出膝关节缺损区,制备冰冻切片,通过荧光显微镜观察,发现在软骨缺损表面已形成少量类软骨细胞,实验表明Bcl-xL基因修饰后的骨髓基质干细胞可自行定位于软骨缺损表面,并可在较短时间内形成软骨样细胞。真核表达载体pcDNA3-Bcl-xL、pcDNA3分别转染自体骨髓基质干细胞,与鼠尾胶原混悬后注射入已形成膝关节软骨缺损的实验用新西兰白兔的膝关节腔中,分别在手术后6周、12周处理实验动物,取出膝关节缺损区,常规固定、脱水、石蜡包埋,切片后进行组织学染色观察,并进行组织学评分。实验结果表明:实验组较对照组可明显提高关节软骨缺损的修复效果。综上所述,Bcl-xL修饰后不仅可以在体外提高骨髓基质干细胞抵抗凋亡诱导因素引起的细胞凋亡,而且可以在体内显著提高关节软骨缺损修复的效果。非病毒转染方式可有效提高细胞存活同时避免病毒转染所引起的各种潜在风险。采用注射的方法可减少创伤,有利于患者术后早期活动,更适宜于临床应用。鼠尾胶原的应用已获我国FDA认证,本实验亦证明其是一种较为理想的可注射细胞载体。Bcl-xL修饰的骨髓基质干细胞与鼠尾胶原混悬后注射入关节腔的方法有望成为一种无创修复软骨缺损的新策略。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 实验一 Bcl-xL基因的克隆及其真核表达载体的构建
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 实验二 兔骨髓基质干细胞的分离、培养和鉴定
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验三 Bcl-xL修饰后的骨髓基质干细胞 体外生物性能检测
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 实验四 Bcl-xL修饰后的骨髓基质干细胞 体内修复关节软骨缺损的研究
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 全文总结
• 参考文献
• 个人简历以及博士在读期间发表的论文
• 致谢