四川黄龙沟优势兰科植物菌根真菌多样性研究

论文摘要

在自然条件下,兰科菌根真菌对兰花的种子萌发和植株生长都是必不可少的。掌握不同区系的兰科植物菌根真菌多样性,对兰科植物的保育和产业化发展都具有重要的意义。本研究选取了在高原地区四川黄龙沟的两种不同生境中生长的9种优势兰科植物作为研究对象,包括黄花杓兰（Cypripedium flavum）、二叶匍茎兰（Galearis diantha）、少花鹤顶兰（Phaius delavayi）、广布小蝶兰（Ponerorchis chusua）、珊瑚兰（Corallorhiza trifida）、尖唇鸟巢兰（Neottia acuminate）、沼兰（Malaxis monophyllos）、小花舌唇兰（Platanthera minutiflora）和筒距兰（Tipularia szechuanica）。研究分别于兰花萌芽期（4月）、生长期（7月）和果期（9月）采集营养根、根际土壤及无兰区域土壤,进行菌根真菌、菌根内生细菌和土壤真菌的分离鉴定,并调查兰科植物分布区域的土壤极值温度以及9种兰科植物根际土壤理化性质；然后对不同生长季节、不同生境和不同营养方式的菌根真菌多样性进行分析,并以黄龙沟兰花种子和附生兰五唇兰为材料进行室内种子共生萌发试验及原球茎、组培苗回接实验,讨论菌根菌与兰科植物的共生效应。主要结果如下：1、通过切片分离法,共获得菌根真菌菌株66个。形态观察和ITS序列测定相结合的鉴定结果显示,子囊菌为优势种类,以肉座菌目（Hypocreales）、炭角菌目（Xylariales）和柔膜菌目（Helotiales）的种类为主；担子菌则以胶膜菌科（Tulasnellaceae）为主。在9种兰科植物中,只有二叶匐茎兰表现出极高的专一性,其根部内生真菌均属于肉座菌属Hypocrea。物种丰富度和Simpson多样性指数分析表明,林下生境的兰花根部内生真菌多样性在各生长季节基本高于开阔生境。但两种生境的优势兰科植物根部内生真菌的物种多样性随生长季节转变呈现出相似的变化规律。这与高原兰科植物的生长特性及营养供求规律基本相符。2、利用菌根研磨液梯度稀释后进行平板涂布的分离方法,获得33个菌根内生细菌菌株。通过革兰氏染色反应和16SrDNA分子鉴定发现,内生细菌的优势种类为Pseudomonas和Bacillus,其次是以Aranicola sp.为代表的嗜冷细菌,这是首次在地生兰中发现该类细菌。内生细菌群落数量因兰花种类的具体生长环境和生物习性,以及已有内生菌群落的存在状况（主要是菌根真菌的种类）而表现各异。3、通过对土壤温度的持续观察发现,林下的土壤最高低温度在各个生长季节都比开阔生境平均低7℃；林下和开阔生境的土壤最高温度和最低温度的差值分别为9.1℃和7.2℃,差别不大。兰科植物根际土壤理化性质测试结果显示,pH值、有机质含量、矿质元素等指标值因兰花种类和生境显示出一定的差异性。在根际土壤真菌研究方面,3个生长季节的优势兰科植物根际土壤共分离得到真菌菌株58个。与兰科菌根真菌相比,根际土壤开始出现较大量的腐生真菌,如被孢霉属（Mortierella）、木霉属（Trichoderma）等,且土壤真菌在同兰花种类的各个生长季节重复率增加,即具备一定的稳定性和持续性。此外,根际土壤中还出现了云杉菌根真菌、杜鹃菌根菌和地钱内生菌等真菌种类。无兰区域的土壤真菌组成简单,完全是腐生类群。兰科植物的种群分布与土壤真菌之间还是存在一定的联系的。4、利用黄龙沟兰花种子进行的室内种子共生萌发试验中,22个供试菌株为前期分离所得的菌根真菌。结果显示除黄花杓兰和筒距兰之外的几种兰花的种子均表现出较高的萌发率。其中,种子活力较低的少花鹤顶兰、小花舌唇兰和珊瑚兰表现出较活跃的萌发率；而活力较高的黄花杓兰能够共生的真菌种类反而很少。种子萌发到达种胚脱离种皮,明显膨大的程度。研究结果表明种子活力和萌发率之间似乎并不存在既定的正比关系,萌发率同兰科菌根菌与兰花种类间专一性的关系更密切。5、以附生兰五唇兰（Doritis pulcherrima Lindl.）为材料,利用上述22个供试菌株,进行了种子共生萌发、原球茎分化和组培苗回接试验,以探讨附生性兰科植物与温带地生兰菌根真菌的共生效应。经过20周的共生培养,只有2个菌株能使种子表现出萌发迹象；9个菌株能够促使原球茎较好地分化发育出根叶；11个菌株处理苗的平均鲜重增长率高于对照组,其中Mm-1的效果达到极显著水平（a=0.01）。五唇兰在种子萌发阶段的专一性较为严格,但到了成株阶段,共生菌的范围则相对宽松。研究结果表明某些附生兰与共生真菌的专一性会随着兰花的生理生长而发生变化,这可能与兰花种类的生存策略相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 兰科植物菌根真菌的特点概述
• 1.2 兰科植物菌根真菌的多样性研究
• 1.2.1 兰科菌根真菌多样性研究手段的发展
• 1.2.2 兰科菌根真菌分类研究的进展
• 1.2.3 中国兰科菌根真菌分类研究现状
• 1.3 兰科植物菌根真菌的专一性研究
• 1.4 兰科菌根真菌与其它微生物间的联系
• 1.4.1 兰科菌根与其它菌根体系的联系
• 1.4.2 兰科菌根真菌与细菌的联系
• 1.5 兰科菌根真菌的应用前景
• 1.5.1 研制高效的菌根菌剂
• 1.5.2 特殊功能性菌根真菌的筛选
• 1.5.3 促进野生珍稀资源的利用和保护
• 1.6 研究背景
• 1.6.1 研究地介绍
• 1.6.2 不同生境的优势植被分布状况
• 1.6.3 兰科植物的选择
• 1.7 研究意义和技术路线
• 1.7.1 研究意义
• 1.7.2 技术路线
• 2 兰科菌根真菌及内生细菌的分离和鉴定
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1菌根的采集
• 2.1.2 菌根真菌的分离和鉴定
• 2.1.2.1 菌根真菌的分离培养
• 2.1.2.2 菌根真菌的形态鉴定
• 2.1.2.3 菌根真菌的分子鉴定
• 2.1.2.4 系统发育树的构建
• 2.1.3 菌根内生细菌的分离和鉴定
• 2.1.3.1 内生细菌的分离培养
• 2.1.3.2 细菌的革兰氏染色反应
• 2.1.3.3 细菌的分子鉴定
• 2.2 结果和分析
• 2.2.1 兰科菌根真菌的分离状况和初步鉴定
• 2.2.2 兰科菌根真菌的分子鉴定结果及系统发育树
• 2.2.3 细菌的数量和鉴定结果
• 2.2.3.1 兰科内生细菌的数量变化
• 2.2.3.2 细菌的鉴定结果
• 2.3 讨论
• 2.3.1 不同生长季节菌根真菌的分离意义
• 2.3.2 分子生物学对兰科菌根真菌鉴定的作用
• 2.3.3 菌根真菌分离状况分析
• 2.3.4 菌根内生细菌分离状况分析
• 3 兰科菌根真菌的多样性分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 物种丰富度
• 3.1.2 Pielou均匀度指数
• 3.1.3 Simpson指数
• 3.2 结果和分析
• 3.2.1 不同生境的兰科菌根真菌多样性
• 3.2.2 不同营养类型的兰科植物菌根真菌多样性
• 3.3 讨论
• 3.3.1 生长季节对兰科菌根真菌多样性的影响
• 3.3.2 生境对兰科菌根真菌多样性的影响
• 3.3.3 营养方式对兰科菌根真菌多样性的影响
• 4 菌根真菌与兰科植物的共生效应
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 种子的采集和保存
• 4.1.2 TTC法种子活性测定
• 4.1.3 黄龙兰科植物种子室内萌发（in vitro）
• 4.1.4 五唇兰种子、原球茎和组培苗的共生培养
• 4.1.4.1 五唇兰室内种子萌发
• 4.1.4.2 原球茎的分化培养
• 4.1.4.3 组培苗的共生培养
• 4.1.4.4 菌根化检验和数据处理
• 4.2 结果和分析
• 4.2.1 种子的数量和活力状况
• 4.2.2 黄龙沟优势兰科植物种子的室内萌发结果
• 4.2.3 五唇兰的种子萌发、原球茎分化和组培苗回接效果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 TTC染色法测试种子活力的意义
• 4.3.2 地生兰种子活力与萌发的关系
• 4.3.3 附生兰与温带地生兰科菌根真菌的作用
• 5 根际上壤性质及真菌分离研究
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 土壤极值温度调查
• 5.1.2 土壤基础理化性质测定
• 5.1.3 根际土壤真菌的分离和鉴定
• 5.1.3.1 根际土壤的采集
• 5.1.3.2 根际土壤真菌的分离和鉴定
• 5.1.4 无兰科植物分布区域的土壤真菌分离
• 5.2 结果和分析
• 5.2.1 根际土壤极值温度测定结果
• 5.2.2 根际土壤理化性质分析结果
• 5.2.3 根际土壤真菌的分离和鉴定结果
• 5.2.4 无兰区域土壤真菌的分离和鉴定结果
• 5.3 讨论
• 5.3.1 黄龙沟优势兰科植物根际土壤的理化性质特点
• 5.3.2 兰科植物分布与土壤真菌的关系
• 6 结论和展望
• 6.1 结论
• 6.2 展望
• 6.2.1 有效菌株的筛选
• 6.2.2 内生真菌间互作及混合接种
• 6.2.3 内生细菌与真菌的互作机制
• 6.2.4 菌根体系的多重共生
• 7 附录
• 参考文献
• 个人简介
• 导师简介
• 致谢