斜带石斑鱼肝脏代谢相关功能基因cDNA全序列的克隆与分析

论文摘要

肝脏是生物体内最大的、功能很多的腺体器官,参与体内消化、代谢、排泄、解毒和免疫等过程,其中以代谢机能最为重要。为从分子水平研究海水鱼类斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）肝脏淀粉酶、蛋白酶、脂酶和异生素代谢酶等代谢相关重要功能基因结构与功能及其分子进化关系,首次通过RT-PCR和RACE技术成功从斜带石斑鱼中克隆得到淀粉酶（amylase, AMY）、蛋白酶（trypsinogen, TRY）、脂酶（hepatic lipase, HL; liportein lipase, LPL）和谷胱甘肽S-转移酶（glutathione S-transferase, GST）等6种肝脏代谢重要功能基因cDNA全序列,并推测其相应氨基酸序列。克隆获得斜带石斑鱼AMY基因cDNA全长1657 bp,编码512个氨基酸,包含与哺乳动物α-淀粉酶二级结构相似的8个α螺旋和8个β折叠。序列同源性分析发现,斜带石斑鱼与澳洲肺鱼、美洲拟鲽、大西洋鲑、斑马鱼AMY基因序列同源性高达82.4-91.8%,与人、小鼠、鸡AMY基因同源性较低70.1-72.3%。获得斜带石斑鱼TRY基因cDNA全长911 bp,编码242个氨基酸,包含所有丝氨酸蛋白酶中都有的高度保守的催化活性中心。序列同源性分析发现,斜带石斑鱼与牙鲆、金头鲷、鳎、石鲽TRY同源性高达86.8-89.7%,与人、小鼠、斑马鱼胰蛋白酶原同源性较低59.9-64.5%。获得斜带石斑鱼HL、LPL基因cDNA全序列,其中HL基因全长2261 bp,编码494个氨基酸；LPL基因全长2191 bp,编码515个氨基酸,为研究脂质代谢基因的进化和探索鱼类脂代谢机制的形成与演进提供大量数据。比较斜带石斑鱼氨基酸序列与人、鼠、鸡的HL、LPL一级结构,发现与哺乳类动物同源性HL为63.7-66.9%,LPL为54.9-55.7%。与更为进化的真骨鱼类罗非鱼、斑鳢和真鲷等同源性较高,HL为61.9-73.1%,LPL为68.0-80.0%。这与其亲缘远近关系相一致,表明HL、LPL在进化过程中都相对保守。构建系统发生树显示,斜带石斑鱼HL、LPL基因氨基酸序列与大口黑鲈、真鲷等共同占据进化树上独立的分枝,与较为原始的硬骨鱼类中华鲟在进化树上距离较远。获得斜带石斑鱼GSTA、GSTR基因cDNA全序列,其中GSTA全长1008 bp,编码223个氨基酸；GSTR全长1002 bp,编码225个氨基酸。序列分析表明,斜带石斑鱼GSTA基因与鲤鱼、斑马鱼的同源性较高,与大鼠、小鼠、人等哺乳动物同源性较低。而GSTR基因为鱼类所特有并共同占据进化树上独立的分枝,与大鼠、小鼠、人等哺乳动物GST现有的所有类型同源性均很低,并且在进化树上距离也较远。推测斜带石斑鱼肝脏消化相关基因氨基酸序列并对其二级结构进行分析,通过系统进化分析确定其进化位置,为进一步研究其表达调控机理及研发有效提高其表达水平的饲料添加剂奠定基础。对斜带石斑鱼肝脏毒素代谢基因的成功克隆,有利于从基因水平上定向筛选赤潮毒素高效去毒鱼类品系,对进一步研发提高海水养殖鱼食用安全保障的高新技术具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1 前言
• 1.1 肝脏糖类代谢
• 1.2 肝脏蛋白质代谢
• 1.3 肝脏脂代谢
• 1.4 肝脏毒素代谢
• 1.5 分子进化树的统计推断
• 1.6 本文的研究目的与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验鱼
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 试剂盒与试剂
• 2.1.4 引物合成与序列测定
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 斜带石斑鱼AMY、TRY、HL、LPL、GSTA和GSTR基因cDNA核心片段的克隆
• 2.2.2 斜带石斑鱼AMY、TRY、HL、LPL、GSTA和GSTR基因cDNA 5’末端的克隆
• 2.2.3 斜带石斑鱼AMY、TRY、HL、LPL、GSTA和GSTR基因cDNA 3’末端的克隆
• 2.2.4 同源性分析、分子模型及系统进化树构建
• 3 实验结果与分析
• 3.1 斜带石斑鱼肝脏、肝胰脏总RNA的提取
• 3.2 斜带石斑鱼AMY基因cDNA全序列克隆与分析
• 3.2.1 斜带石斑鱼AMY基因全长cDNA序列的克隆
• 3.2.2 斜带石斑鱼AMY与其它生物AMY同源性比较、分子模型构建及系统进化分析
• 3.3 斜带石斑鱼TRY基因cDNA全序列克隆与分析
• 3.3.1 斜带石斑鱼TRY基因全长cDNA序列的克隆
• 3.3.2 斜带石斑鱼TRY与其它生物TRY同源性比较及系统进化分析
• 3.4 斜带石斑鱼HL、LPL基因cDNA全序列克隆与分析
• 3.4.1 斜带石斑鱼HL、LPL基因全长cDNA序列的克隆
• 3.4.2 斜带石斑鱼HL、LPL与其它生物HL、LPL同源性比较及系统进化分析
• 3.5 斜带石斑鱼GSTA、GSTR基因cDNA全序列克隆与分析
• 3.5.1 斜带石斑鱼GSTA、GSTR基因全长cDNA序列的克隆
• 3.5.2 斜带石斑鱼GSTA、GSTR与其它生物GST同源性比较及系统进化分析
• 4 讨论
• 4.1 斜带石斑鱼肝脏糖类代谢基因
• 4.2 斜带石斑鱼肝脏脂代谢基因
• 4.3 斜带石斑鱼肝脏去毒基因
• 参考文献
• 在学期间发表论文清单
• 致谢