苦荞16kDa主要过敏原的原核表达纯化、免疫活性分析及转化拟南芥研究

论文摘要

苦荞具有很高的营养价值和药用价值,其蛋白质、脂肪和纤维素都普遍高于其他粮食作物,而且它还含有其他作物所没有的叶绿素和生物类黄酮物质。然而,苦荞中过敏成分的存在大大阻碍了苦荞食品的开发利用。近年来,国内外的许多学者对甜荞中的过敏成分进行了广泛的研究,其中报道的比较多的是甜荞16kDa过敏原。甜荞16kDa过敏原是2S清蛋白家族成员,被认为是甜荞中的主要过敏原之一,其具有强的抗胃蛋白酶活性。也有文献报道,甜荞16kDa过敏原与过敏性休克相关。关于苦荞中的过敏成分,国内外的相关报道较少,目前鉴定出的大多是高分子量过敏性蛋白。本研究以苦荞种子发育期cDNA文库中分离筛选的EST序列（GenBank登录号为:GO496294）为基础,进行核酸序列分析及功能结构预测,结果显示该基因包含450bp的读码框（ORF）,全基因编码149个氨基酸残基的分子量为17.2kDa的蛋白,N端具有19个氨基酸的信号肽。同源分析显示,其氨基酸序列与报道的甜荞16kDa过敏原具有83%的相似性。三级结构和二级结构的预测结果都显示该基因编码的蛋白是由4个α-螺旋组成的紧凑结构。功能结构预测发现其编码蛋白具有α-淀粉酶抑制剂（AAI）结构域。抗原表位预测显示,其具有6个可能的线性表位。分别以全长基因（450bp/149aa）和去掉信号肽的部分基因（384bp/23-149aa）为编码框,分别构建原核表达载体pET47b-TBW16和pET47b-cTBW16,并转化大肠杆菌进行原核表达。结果显示,两个基因对应的蛋白（rTBW16和rcTBW16）都以包涵体的形式分别在大肠杆菌Rosetta gami 2（DE3）和BL21 star（DE3）中高效表达。分别对表达的蛋白进行包涵体纯化、复性研究及钴柱亲和层析纯化。包涵体复性过程中发现,与rcTBW16相比,rTBW16出现大量沉淀,复性效率低。用竞争性ELSIA分别对苦荞天然16kDa过敏原（ncTBW16）和rcTBW16进行免疫活性检测,结果显示ncTBW16和rcTBW16都具有较高的免疫活性。用两个荞麦过敏患者的血清和两个对照血清对苦荞种子总蛋白和重组rcTBW16分别进行IgE免疫印迹分析,结果发现,两个阳性血清在16kDa处都有杂交信号,证明该蛋白为苦荞16kDa的过敏原。该苦荞16kDa过敏原被国际免疫学会联盟（IUIS）过敏原命名小组委员会命名为Fag t 2.以rcTBW16为抗原制备了高效价的多克隆抗体。用所制备的多克隆抗体对苦荞种子总蛋白、清蛋白、球蛋白和HCl提取蛋白进行了Western Blotting分析。结果显示,苦荞16kDa过敏原存在于清蛋白中,说明它是2S清蛋白家族的成员。苦荞种子胚和胚乳样品的Western Blotting分析结果表明,苦荞16kDa过敏原只存在于胚中。利用PAGE结合Western Blotting检测、胶回收等技术从苦荞种子中分离出ncTBW16,并进行N端氨基酸测序以及质谱鉴定。结果表明,所测N端氨基酸序列与天然成熟的甜荞16kDa过敏原的N端序列完全相同,并且质谱鉴定结果也表明所分离的苦荞16kDa蛋白与重组蛋白完全对应。利用SDS-PAGE和ELSIA技术对复性的rcTBW16和ncTBW16的热稳定性进行分析发现,在中性条件下二者在100℃加热150min后仍然以可溶状态存在,并且仍具有94%的IgE结合活性。利用Satoru等人的方法对rcTBW16和ncTBW16进行了胃蛋白酶消化实验,结果表明,rcTBW16和ncTBW16具有胃蛋白酶抗性。此外,用3, 5-二硝基水杨酸法测定rcTBW16的α-淀粉酶抑制剂活性,结果显示rcTBW16没有明显的抑制α-淀粉酶的活性。构建了植物表达载体pBIN438-TBW16,并且通过农杆菌介导转化到拟南芥中。通过卡那抗生素筛选初步得到了阳性植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 过敏反应概述
• 1.1.1 过敏反应的机制
• 1.2 植物过敏蛋白
• 1.2.1 植物过敏蛋白的分类
• 1.2.2 植物过敏原蛋白的特性
• 1.2.3 植物过敏原蛋白的生理功能
• 1.3 低敏植物性食品的开发研究
• 1.3.1 低敏植物品种的培育
• 1.3.2 植物性食品的脱敏
• 1.4 荞麦过敏的研究现状
• 1.4.1 荞麦过敏症研究
• 1.4.2 荞麦中过敏蛋白研究
• 1.5 选题依据
• 第二章 苦荞16kDa 过敏原cDNA 序列的生物信息分析
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 TBW16 的序列分析
• 2.2.2 TBW16 的功能结构预测
• 2.2.3 TBW16 系统发育树的构建及抗原表位预测
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 TBW16 的序列分析
• 2.3.2 TBW16 的功能结构预测
• 2.3.3 TBW16 系统发育树的构建及抗原表位预测
• 2.4 讨论
• 第三章 苦荞16kDa 过敏原表达载体的构建及原核表达
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 主要的工具酶、试剂和溶液
• 3.1.3 主要实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 苦荞过敏原的原核表达载体构建
• 3.2.2 目的基因在大肠杆菌中的表达
• 3.2.3 目的蛋白表达条件的优化
• 3.2.4 目的蛋白可溶性表达分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 16kDa 过敏原基因的 PCR 扩增
• 3.3.2 重组表达质粒双酶切鉴定
• 3.3.3 目的蛋白表达检测
• 3.3.4 目的蛋白的表达条件优化
• 3.3.5 目的蛋白可溶性表达分析
• 3.4 讨论
• 第四章 rTBW16 和rcTBW16 的包涵体复性及亲和纯化
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 包涵体复性溶液
• 4.1.2 蛋白纯化溶液
• 4.1.3 主要仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 包涵体的纯化
• 4.2.2 包涵体复性
• 4.2.3 钴离子螯合层析纯化目的蛋白
• 4.2.4 目的蛋白His 标签鉴定
• 4.2.5 多克隆抗体制备
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 包涵体的纯化
• 4.3.2 包涵体复性
• 4.3.3 钴离子金属螯合层析纯化目的蛋白
• 4.3.4 目的蛋白His 标签的鉴定
• 4.4 讨论
• 第五章 重组蛋白（rcTBW16）的免疫活性鉴定
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 血清材料
• 5.1.2 ELISA 试剂与材料
• 5.1.3 免疫印迹试剂与材料
• 5.1.4 主要仪器
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 竞争性ELSIA
• 5.2.2 IgE 免疫印迹
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 竞争性ELISA
• 5.3.2 IgE 免疫印迹
• 5.4 讨论
• 第六章 天然TBW16 的定位及分离鉴定
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 试剂
• 6.1.3 PAGE 电泳试剂
• 6.1.4 Western blotting 试剂
• 6.1.5 电洗脱试剂
• 6.1.6 实验仪器
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 苦荞种子清蛋白、球蛋白的 Western blotting 分析
• 6.2.2 苦荞种子胚和胚乳的Western blotting 分析
• 6.2.3 天然TBW16 的分离鉴定
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 苦荞种子清蛋白、球蛋白的 Western blotting 分析
• 6.3.2 胚和胚乳蛋白的 Western blotting 分析
• 6.3.3 苦荞16kDa 过敏原的分离及Western blotting 鉴定
• 6.3.4 N 端测序及质谱鉴定
• 6.4 讨论
• 第七章 TBW16 稳定性分析及α-淀粉酶抑制剂活性鉴定
• 7.1 实验材料
• 7.1.1 主要材料
• 7.1.2 主要试剂
• 7.1.3 主要仪器
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 TBW16 的热稳定性分析
• 7.2.2 TBW16 的胃蛋白酶消化实验
• 7.2.3 α-淀粉酶抑制剂的活性测定
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 TBW16 的热稳定性分析
• 7.3.2 胃蛋白酶消化实验
• 7.3.3 α-淀粉酶抑制剂活性测定
• 7.4 讨论
• 第八章 苦荞 16kDa 过敏原的植物表达载体构建及转化拟南芥
• 8.1 实验材料
• 8.1.1 材料
• 8.1.2 实验试剂
• 8.1.3 主要仪器
• 8.2 实验方法
• 8.2.1 植物表达载体构建
• 8.2.2 拟南芥的培养
• 8.2.3 转化拟南芥
• 8.2.4 阳性植株的筛选
• 8.3 结果与分析
• 8.3.1 重组载体 pBIN438 的双酶切鉴定
• 8.3.2 阳性植株的筛选
• 8.4 讨论
• 第九章 总结与展望
• 9.1 总结
• 9.2 展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介