保靖黄金茶资源多样性分析及CsICE1基因转化烟草研究

论文摘要

茶树起源于我国云南,在我国南方热带与亚热带温暖湿润、雨量充沛的自然环境下,形成了喜温畏寒的特性。低温是茶树地理分布的主要限制因素,近年来,我国茶叶主产区冬季低温冻害、春季倒春寒等极端气候,严重影响茶叶品质与产量,因而茶树抗寒机理成为茶树栽培育种的研究热点。保靖黄金茶是近年来湖南省发现的特异、珍稀茶树群体品种,具有萌芽早、产量高、品质优、抗性强等特点。本试验收集了111个黄金茶株系,分析其遗传多样性,为保靖黄金茶群体品种的保护、开发及利用提供分子水平的依据。此外,由于保靖黄金茶抗寒性强的特点,在2008年我国南方20余天的罕见冰冻灾害中,群体中有许多单株所受冻害小于该县栽种的福鼎大白茶。基于此,研究保靖黄金茶低温胁迫相关基因CsICEl的功能,对研究茶树抗寒分子机制及选育抗寒茶树新品种具有重要意义。本文主要研究结果如下：1.选取20个早发株系,研究其在2011、2012年春茶期间主要化学成分动态变化。结果表明,8号株系具有萌芽早、高氨基酸、高茶氨酸等特点,结合其酚氨比,初步推测8号株系应是一个很好的适制名优绿茶的茶树资源。2.应用AFLP-银染技术,分析黄金茶群体111个株系的遗传多样性与亲缘关系。选用多态性高、分辨力强的引物组合E37M32、E41M33与E41M42分别扩增样品基因组DNA,共得到229条清晰条带,其中多态性条带186条,多态位点百分比为81.22%,反映了样品基因组DNA具有较高的多态性。111个样品得出的的平均有效等位基因数（Ne）为1.42±0.35,平均Nei’s基因多样性（H）为0.25±0.18,平均Shannon’s信息指数（I）为0.38±0.25。应用NTSYSpc2.1软件,计算得到111个样品间的相似系数在0.65～0.99之间,平均为0.76。根据UPGMA法,将111个株系分成8大类群,.绘制样品AFLP聚类树状图。本研究为黄金茶种质资源的保护及利用,从分子水平提供了一定的依据。3.研究保靖黄金茶4℃培养条件下,低温诱导相关基因在不同时间的表达情况,根据RT-qPCR结果,推测CsICE1, CsRAV, CsDHN2为组成型表达；CsCBF1, CsERF, CsRbcS, CsDHN1为诱导型基因,这些基因在茶树应对低温胁迫时发挥重要作用。4.通过pCX-DG双元载体构建了茶树CsICE1基因的过表达载体,并将其成功转入根癌农杆菌GV3101中。5.通过农杆菌感染叶盘法成功得到转CsICE1基因烟草,并对其T1代进行了耐低温检测,证明了转CsICE1基因能增强烟草的抗低温胁迫能力,为通过基因工程手段提高常规茶树品种的抗寒性奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩写词（Abbreviation）
• 目录
• 第一章 绪论
• 1 遗传多样性研究综述
• 1.1 遗传多样性的含义
• 1.2 遗传多样性的研究意义
• 2 茶树种质资源遗传多样性研究进展
• 2.1 基于形态学和生物学的茶树遗传多样性研究
• 2.2 基于生理生化的茶树遗传多样性研究
• 2.3 基于细胞水平的茶树遗传多样性研究
• 2.4 基于DNA分子标记的茶树遗传多样性研究
• 3 湖南茶叶概况
• 3.1 湖南省茶业发展概况
• 3.2 湖南省茶树资源概况
• 3.2.1 湖南省茶树资源现状
• 3.2.2 保靖黄金茶茶树资源现状
• 4 茶树基因功能研究进展
• 4.1 农杆菌介导茶树遗传转化体系的探索
• 4.2 基因枪技术应用于茶树遗传转化
• 4.3 验证茶树目的基因的功能
• 4.4 茶树转基因技术展望
• 4.4.1 存在问题
• 4.4.2 应用前景
• 5 本研究的目的与意义
• 6 研究内容
• 7 技术路线
• 第二章 保靖黄金茶早发株系春茶生产期间主要化学成分动态变化研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、主要仪器与试剂
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 样品前处理
• 1.2.2 茶多酚总量测定
• 1.2.3 总氨基酸测定
• 1.2.4 茶氨酸测定
• 2 结果与分析
• 2.1 春茶生产期间茶多酚含量的动态变化
• 2.2 春茶生产期间总氨基酸含量的动态变化
• 2.3 春茶生产期间茶氨酸含量的动态变化
• 2.4 春茶生产期间酚氨比的动态变化
• 3 讨论
• 3.1 选育适制名优绿茶茶树新品种的意义
• 3.2 保靖黄金茶群体品种中适制名优绿茶茶树资源的初步筛选
• 4 本章小结
• 第三章 保靖黄金茶种质资源遗传多样性的AFLP分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、主要仪器与试剂
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 样品基因组DNA提取
• 1.2.2 AFLP分析
• 1.2.3 数据处理及分析
• 2 结果与分析
• 2.1 111个样品的AFLP扩增结果
• 2.2 黄金茶群体的遗传多样性
• 2.3 黄金茶群体各株系间的亲缘关系
• 3 讨论
• 3.1 AFLP-银染技术在茶树种质资源遗传多样性与亲缘关系研究中的高效性
• 3.2 统计分析结果与前人的比较
• 4 本章小结
• 第四章 保靖黄金茶低温诱导抗寒相关基因的表达研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、主要仪器与试剂
• 1.1.1 试验材料
• 1.1.2 主要仪器
• 1.1.3 主要试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 总RNA提取、纯化及检测
• 1.2.2 RT-qPCR验证基因表达水平
• 1.2.3 目的基因扩增效率分析
• 2 结果与分析
• 2.1 样品总RNA完整性及纯度
• 2.2 目的基因扩增效率分析
• 2.3 CsICE1、CsCBF1基因的表达变化
• 2.4 CsERF基因的表达变化
• 2.5 CsRAV基因的表达变化
• 2.6 CsRbcS基因的表达变化
• 2.7 CsDHN1、CsDHN2基因的表达变化
• 3 讨论
• 3.1 低温对CsICE1、CsCBF1基因表达的影响
• 3.2 低温对CsERF基因表达的影响
• 3.3 低温对CsRAV基因表达的影响
• 3.4 低温对CsRbcS基因表达的影响
• 3.5 低温对CsDHN1、CsDHN2基因表达的影响
• 4 本章小结
• 第五章 茶树CsICE1基因过表达载体构建
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、仪器与试剂
• 1.1.1 菌种与质粒
• 1.1.2 主要试剂
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 总RNA的提取及cDNA第一链合成
• 1.2.2 CsICE1基因的PCR扩增
• 1.2.3 CsICE1基因的片段回收
• 1.2.4 CsICE1基因的回收产物加A尾
• 1.2.5 pCX-DG载体酶切及片段回收
• 1.2.6 CsICE1过表达载体构建
• 1.2.7 植物过表达载体pCX-DG-CsICE1导入农杆菌
• 2 结果与分析
• 2.1 黄金茶CsICE1基因的ORF序列克隆
• 2.2 pCX-DG载体的酶切回收
• 2.3 转化子验证
• 3 讨论
• 3.1 抗寒目的基因的选择
• 3.2 表达载体的构建
• 3.2.1 过表达载体pCX-DG的优点
• 3.2.2 影响限制性内切酶酶切效果的因素
• 3.2.3 连接片段的浓度比以及酶的选择
• 4 本章小结
• 第六章 根癌农杆菌介导CsICE1基因过表达载体转化烟草研究
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料、仪器与试剂
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要培养基
• 1.2 试验方法
• 1.2.1 烟草材料的准备
• 1.2.2 工程菌转化烟草
• 1.2.3 抗性植株的分子生物学检测
• 1.2.4 T1代转基因烟草耐低温检测
• 2 结果与分析
• 2.1 农杆菌介导的遗传转化及植株再生
• 2.2 转化材料中的GFP表达
• 2.3 抗性植株的分子生物学检测
• 2.3.1 转pCX-DG-CsICEl的PCR检测
• 2.3.2 转基因植株的半定量RT-PCR分析
• 2.3.3 T1代转基因烟草的耐低温检测
• 3 讨论
• 3.1 农杆菌
• 3.2 试验操作
• 3.3 GFP在遗传转化中的应用前景
• 3.3.1 优越性
• 3.3.2 注意事项
• 3.3.3 存在的问题
• 4 本章小结
• 全文总结
• 1 主要研究结果
• 2 主要创新点
• 3 展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 参与课题
• 获奖
• 发表的文章