论文摘要
背景介绍抗菌肽（antibacterial peptides）是固有性免疫的效应分子,是生物免疫系统产生的一类抵抗外界病原体感染的多肽。1981年,Boman等从天蚕中纯化出第一种天然抗菌肽-天蚕素（cecropin）,两年后,从兔吞噬细胞中分离出另一种抗菌肽-防御素（defensins）。到现在为止,已发现抗菌肽广泛存在于昆虫、植物、动物及人体内。抗菌肽具有分子量小、热稳定性好、水溶性好、无免疫原性和抗菌谱广的特点。除非特异性的抗细菌、真菌、病毒等病原体外,还有抗肿瘤细胞的作用,特别是对多重耐药菌和肿瘤细胞有杀伤作用,而不破坏人体的正常细胞,是一类具有巨大发展潜力的新型抗菌药,是目前抗病原微生物药物开发研究中的一个热点。目的诱导和分离纯化家蝇（Musca domestica）幼虫免疫血淋巴中的抗菌肽,研究抗菌肽的性质和抑菌特性,观察抗菌肽对铜绿假单胞菌和阴沟肠杆菌感染小鼠创面的抗菌作用,为进一步研究家蝇幼虫抗菌肽的制备及应用提供实验基础。方法1.家蝇及幼虫养殖是提取抗菌肽的前提条件,经过反复试验建立稳定的室内养殖方法和条件。2.通过超声处理诱导家蝇幼虫产生免疫血淋巴,经沸水浴热变性,结合高速离心,两步CM-Sepharose离子交换层析,冷冻干燥浓缩等步骤,分离得到一种具抗菌活性的蛋白质。用Tricine SDS-PAGE鉴定抗菌肽的纯度和性质,抑菌试验分析抗菌肽的抑菌特性。3.取ICR小鼠40只,切除背部全层皮肤（创面为1cm×1cm）,其中10只作为无菌对照,另30只创面涂抹铜绿假单胞菌菌液作为感染模型,随机分为对照组,磺胺米隆组和抗菌肽组。伤后2h和每天分别用等渗生理盐水、100g/L的磺胺米隆、0.1g/L抗菌肽滤纸湿敷,伤前和伤后3天抽血观察白细胞变化;观察小鼠重量的变化和14天后的存活率。4.取ICR小鼠30只,切除背部1cm×1cm全层皮肤,涂抹阴沟肠杆菌菌液作为感染模型,随机分为3组。伤后2h和每天各组分别用等渗生理盐水、100g/L的磺胺米隆或0.1g/L抗菌肽滤纸湿敷,伤前和伤后3天抽血观察白细胞变化;伤后3天痂下肌肉组织细菌定量和计算存活率。结果1.家蝇正常生长需要一定的光照时间和充足的营养。家蝇生长的适宜温度为25℃～35℃,相对湿度宜保持在60%～70%。幼虫生长发育的温度通常是22℃～36℃,最佳温度是26℃,要求充足的养料,含水量50%～60%最适宜,可接受少量光照。2. 300W,50Hz超声处理60s能够诱导家蝇幼虫产生抗菌肽,经分离纯化后Tricine SDS-PAGE凝胶电泳结果显示为一条带,相对分子量大约为5 800。纯化蛋白对阴沟肠杆菌,铜绿假单杆菌等G-杆菌的抑菌活性较强,而对G+金黄色葡萄球菌效果不显著。3.对铜绿假单胞菌感染的ICR小鼠的试验发现对照组小鼠相比其它两组活动减少,术后三组白细胞计数均减少。14天后对照组存活率为30%,明显少于磺胺米隆组90%（P<0.05）和抗菌肽组80%（P<0.05）。对照组小鼠的重量在第6天开始下降,明显少于其它两组（P<0.05）。而无菌对照组无死亡,重量持续增加。4.对阴沟肠杆菌感染的ICR小鼠创面的试验发现术后3组白细胞计数均减少,对照组显著低于其它两组（P<0.05）;痂下肌肉组织细菌定量抗菌肽组（99±32）×102 CFU/g和磺胺米隆组（87±31）×102 CFU/g,均显著低于对照组（504±338）×103 CFU/g（P<0.01）;对照组术后3天存活率明显少于其它两组（P<0.05）。结论1.建立了可培育发育正常的家蝇及蝇幼虫条件。2.诱导和纯化了一种对G-杆菌有较高抗菌活性的家蝇幼虫抗菌肽,为此类活性物质的分离纯化提供了有效的方式。3.纯化后的家蝇幼虫抗菌肽对铜绿假单胞菌感染的ICR小鼠创面有较强抗感染作用,能明显增加其存活率。4.纯化后的家蝇幼虫抗菌肽对阴沟肠杆菌感染的ICR小鼠创面也有较强抗感染作用。