籼稻组织培养体系的优化及水稻抗病相关基因22E6EI14的功能鉴定

论文题目: 籼稻组织培养体系的优化及水稻抗病相关基因22E6EI14的功能鉴定

论文类型: 硕士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 葛小佳

导师: 王石平

关键词: 愈伤组织,诱导,继代,农杆菌介导的遗传转化,籼稻

文献来源: 华中农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 白叶枯病（Bacterial Blight，BB）是世界各地水稻生产中危害十分严重的病害之一，由黄单胞杆菌水稻变种（Xanthomonas oryzae pv．Oryzae，Xoo）引起。借助于转基因技术的抗病育种被认为是有效而直接的方式越来越受到人们的重视。目前，至少有8个水稻白叶枯抗性基因（Xa1，Xa2，Xa3，Xa4，xa5，Xa10，xa13和Xa21）被转入籼稻品种IR24中，产生了一系列以IR24为遗传背景的抗白叶枯近等基因系。本室在水稻白叶枯病抗性基因的克隆和相关基因的鉴定上开展了大量的工作，已经将Xa4和xa13定位于来自近等基因系品种的DNA片段中，另外，从这些近等基因系中也获得了大量的抗病相关基因。然而，目前对该基因型品种的组织培养体系还不成功，大大限制了这些抗病基因和抗病相关基因的功能验证。因此，本研究立足服务于本室的白叶枯病抗病基因克隆和转基因的需要，通过对籼稻组织培养体系的优化，摸索一套适合于以IR24为代表的白叶枯病近等基因系的转基因组培体系，从而可以推动抗白叶枯病研究的进程。同时，由于IR24也是国际上，尤其是东南亚、南亚国家主栽品种的亲本来源之一，以该基因型为背景的有关水稻各性状的研究开展得非常广泛，因此，该转基因体系的建立可以更好地推动基因工程育种。通过调整培养基中植物生长调节因子（plant growth regulators，PGRs）、有机成分和无机盐的水平，分别筛选出适合籼稻的愈伤诱导以及继代的培养基。实验表明：IRBB13、IRBB10、IRBB4、IR24、明恢63、珍汕97和93-11共7个籼稻品种的成熟种子通过优化培养基的诱导以及继代过程，能够产生大量胚性愈伤；相对于MS基本培养基，愈伤组织的生长率和再生率都得到了提高，能够作为农杆菌介导的遗传转化的理想受体。另外，参考本室林拥军老师建立的籼稻遗传转化体系，在这两种培养基的基础上，进一步确立了转化过程中预培养、共培养以及筛选的培养基，并完成了IRBB13的高效遗传转化。另外，本室储昭晖利用同源序列法在明恢63中分离了基因22E6EI14，表达分析表明该基因在抗病品种IRBB13中受白叶枯病原菌PXO99接种诱导表达，而在感病品种IR24中不表达，由此，储昭晖推测其可能参与xa13基因介导的抗病反应途径。为了验证抗病相关基因22E6EI14的功能，本研究利用双链RNA表达抑制（double-strand RNA interference,dsRNAi）技术对该基因进行表达抑制的遗传转化，观察转化植株的抗病表型变化。通过3’-RACE（3’-rapid amplification of cDNA end）和RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）分析，确定了22E6EI14的转录终止位点及基因内含子的剪切位点，序列分析显示该基因编码NBS类蛋白质。构建22E6EI14的双链RNA表达抑制载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法转入抗病品种IRBB13，抑制该基因的表达。对获得的39株T0代转化植株进行PCR阳性检测，其中有23

论文目录:

中文摘要

ABSTRACT

前言

1 文献综述

1.1 农杆菌介导的遗传转化方法

1.1.1 发展现状

1.1.2 建立高效的籼稻组织培养体系

1.1.2.1 影响植物组织培养过程的各个因素

1.1.2.2 籼稻组织培养的发展现状

1.2 同源序列法克隆抗病基因

1.2.1 抗病基因的保守结构域

1.2.2 RGAs在克隆抗病基因中的应用

1.2.2.1 RGAs作为分子标记

1.2.2.2 RGAs与抗病基因紧密连锁

1.2.2.3 利用RGAs成功克隆R基因

1.2.2.4 在基因组水平上研究RGAs

1.2.3 RGAs的其它应用

1.3 植物抗病的分子机制研究进展

1.3.1 植物抗病基因(resistance genes,R genes)

1.3.2 病原物无毒基因(avirulence genes,Avr genes)

1.3.3 R蛋白与Avr蛋白的识别过程

1.3.3.1 NBS-LRR类蛋白与其无毒蛋白的识别过程

1.3.3.2 Pto与其无毒蛋白的识别过程

1.3.4 系统的诱导抗病(induced defence responses)

1.3.4.1 系统获得抗病性(systemic acquired resistance,SAR)

1.3.4.2 诱导的系统抗性(induced systemic resistance,ISR)

1.3.5 植物抗病反应中的信号传导途径

1.3.5.1 植物抗病反应中的信号传导网络

1.3.5.2 促分裂原活化蛋白激酶

1.3.6 植物的非寄主抗性(nonhost resistance)

1.3.7 植物抗病机理研究在生产上的应用

2 研究目的与意义

材料和方法

1 材料

1.1 组织培养系统优化中使用的籼稻品种

1.2 组织培养系统优化中使用的培养基

1.3 载体构建所用质粒

1.4 遗传转化中的农杆菌菌株和受体品种

1.5 遗传转化中使用的培养基

1.6 接种用白叶枯病菌株和水稻品种

2 实验方法

2.1 组织培养系统优化中愈伤的诱导、继代和分化

2.2 组织培养系统优化中数据分析

2.3 组织细胞学观察

2.4 总RNA的抽提

2.5 22E6EI14的RT-PCR和3’-RACE分析

2.6 双链RNA表达抑制转化载体的构建

2.7 农杆菌介导的遗传转化

2.8 转基因植株的PCR阳性检测

2.9 病原菌接种转基因植株

2.10 Southern blot杂交分析外源片段的插入拷贝数

2.11 T_0代转基因植株22E6EI14表达分析

2.12 T_1代转基因植株共分离检测

结果和分析

1 籼稻组织培养体系的优化

1.1 诱导培养基的优化

1.2 继代培养基的优化

1.3 诱导培养基、继代培养基和基因型三个因素对于愈伤再生能力的影

2 双链RNA表达抑制验证22E6EI14的功能

2.1 22E6EI14结构的预测

2.2 22E6EI14转录序列分析

2.3 双链RNA表达抑制载体ds22E6EI14的构建

2.4 双链RNA表达抑制的遗传转化

2.5 T_0代转基因植物的PCR阳性检测

2.6 T_0代转基因植株接种白叶枯致病菌PXO99

2.7 Southern Blot杂交分析外源片段的插入拷贝数

2.8 T_0代转基因植株22E6EI14表达分析

2.9 T_1代转基因植株共分离检测

讨论

1 成熟种子作为水稻组织培养的外植体

2 诱导培养基对于愈伤再生能力的影响

3 植物生长调节因子

4 水稻基因型对于组织培养的影响

5 缺少LRR结构域的NBS-LRR类蛋白

6 利用同源序列法克隆抗病基因

7 关于22E6EI14的功能

参考文献

附录

致谢

发布时间: 2006-12-12

参考文献

[1].三叶青不定根组培快繁体系的建立与应用研究[D]. 钱丽华.浙江大学2013
[2].玉米愈伤组织在长期继代下生长特性的变化及差异表达蛋白质分析[D]. 付小康.河南农业大学2017
[3].小麦愈伤组织继代过程中的同工酶谱研究[D]. 王志强.河南农业大学2004
[4].不同激素种类和配比对杜梨组培继代苗愈伤组织发生及状态的影响[D]. 李本波.河北农业大学2010
[5].玉米幼胚培养系统优化及硝态氮代谢与幼胚培养关系的研究[D]. 秦文娟.河南农业大学2009
[6].小麦粒重相关基因TaGW2的单倍型分析及其农杆菌介导的遗传转化体系优化[D]. 郑冠鹏.西北农林科技大学2018
[7].丹酚酸B生物合成关键基因在丹参叶片分化不定芽中的表达[D]. 马健.河北大学2018
[8].Picloram诱导小麦成熟胚再生及遗传转化的初步研究[D]. 彭亚博.郑州大学2018
[9].籼稻明恢86多基因遗传转化及再生体系的优化[D]. 魏林艳.福建农林大学2018
[10].小麦愈伤组织再生相关基因TaTCP-1的克隆及功能鉴定[D]. 黎飞飞.西北农林科技大学2014

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