西瓜花药和小孢子培养研究

论文摘要

在西瓜单倍体育种技术中,通过离体培养诱导西瓜花药产生单倍性胚性愈伤组织,进而诱导产生胚状体和单倍体再生植株,能简化花药培养的过程,加快单倍体育种的进程。西瓜研究主要集中在茎尖培养、原生质体培养、体细胞杂交、基因转化和诱导体细胞无性系变异等生物技术途径上,在西瓜上生物技术的应用途径也在不断拓宽,其研制和开发有了长足的进展。但是通过花药培养进行西瓜的单倍体育种仍有很大的局限性。本实验以北京蔬菜研究中心的ZW22、ZW23、ZW24、ZW25、ZW26、ZW27、261、271、331号（ZW系列属于京欣系列瓜种,其余的均是野生品种）具有较多优良性状的F1代九种不同基因型西瓜品种为材料,用DAPI荧光染色法检测花粉发育的时期,确定花蕾发育和花粉发育时期的关系,分别以花蕾的低温处理和接种花药的高温预培养,光暗的对比培养,不同蔗糖浓度的培养以及12种不同激素组合的诱导培养基,探索西瓜花药发育途径和培养过程中的各种影响因素;通过观察花药小孢子的最佳发育时期,优化花药预处理的条件,同时对于不同状态的西瓜花药愈伤组织进行分化处理,主要取得了以下的结果。1、在西瓜花药诱导愈伤组织的培养中,开花前期的花药,愈伤组织诱导频率较高,且愈伤组织生长迅速、质地致密,具有良好的分化潜力。2、西瓜花药培养的最佳时期是单核靠边期到双核期,在试验中以花药的色泽和花蕾的大小作为初步确定小孢子发育时期的标志。3、西瓜花药培养受多种因素的影响,既包括由植株本身所决定的基因型差异、小孢子的发育阶段、花蕾的预处理及供体植株的生理状态等内在条件,也包括基本培养基成分--糖类、激素及培养条件等外界因素。研究表明,花蕾4℃处理2d再将接种后的花药放入4℃冰箱预处理2d的诱导率最高,达到了57.84%。高温预处理的褐化率很高,不易导出绿色致密的愈伤组织。黑暗条件比较容易产生愈伤组织,但是愈伤组织的质地很疏松,颜色发白;光照条件下产生愈伤组织比较慢,但质地很致密,颜色绿。在对ZW24和331号两品种的对比试验中,野生种331号在该培养基上愈伤组织诱导率达到了68.42%。4、建立了西瓜花药愈伤组织诱导的实验体系。确定了西瓜花药愈伤组织诱导的最佳培养基为MS+KT0.5mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA2.0mg/L,最佳预处理条件为4℃2d的处理,为基因转化、细胞培养等方面的研究提供有用的参考数据。5、固体培养时,蔗糖浓度60g/L的培养效果最好;在花药愈伤组织的增殖培养中加入三十烷醇有利于提高绿色愈伤组织的诱导率。将长势较好的愈伤组织转到MS+三十烷醇2.0mg/L+6-BA 0.5mg/L上,76%的愈伤组织再生出丛生芽。丛生芽在MS+0.5mg/L的IBA上长出了根。6、游离小孢子培养的过程中,早上采集花蕾其花粉活力较强。游离小孢子不同温度处理以低温4℃处理效果最差,高温热激36℃处理4d的效果较好。不同基因型的品种对温度处理的敏感性不同,ZW22、ZW23、261号、271号4个品种比较,小孢子脱分化率最高的品种是271号。小孢子进行热激处理后,在1/2NLN液体培养基上培养,小孢子膨大、分裂,形成不规则的细胞团和肉眼可见的愈伤组织颗粒。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 单倍体培养机理
• 1.2 西瓜花药培养现状
• 1.3 影响花药培养的因子
• 1.3.1 基因型
• 1.3.2 供体植株的生长状况
• 1.3.3 花粉的发育时期
• 1.3.4 材料的预处理和预培养
• 1.3.5 培养基
• 1.3.6 蔗糖浓度
• 1.3.7 培养条件
• 1.4 小孢子培养的概述
• 1.4.1 分离小孢子的方法
• 1.4.2 离体条件下小孢子的发育途径
• 1.4.3 影响小孢子培养的因子
• 1.4.3.1 基因型
• 1.4.3.2 供体植株的生长环境
• 1.4.3.3 培养前高温热激处理
• 1.5 存在的问题
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 西瓜花药离体培养研究
• 2.1 供试材料
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 取材
• 2.2.2 外植体消毒和接种
• 2.2.3 基本培养条件
• 2.3 试验设计
• 2.3.1 花蕾形态和小孢子发育的观察
• 2.3.2 预处理对小孢子活力影响的试验
• 2.3.3 基因型和培养基筛选试验
• 2.3.3.1 基因型
• 2.3.3.2 蔗糖浓度
• 2.3.3.3 激素试验
• 2.3.4 培养条件试验
• 2.3.4.1 高温预培养
• 2.3.4.2 光暗对比培养试验
• 2.3.5 愈伤组织的分化培养
• 3 结果与分析
• 3.1 西瓜花小孢子的发育与花蕾形状
• 3.2 预处理对小孢子活力影响
• 3.3 西瓜花药培养中愈伤组织的诱导与分化
• 3.4 基因型对西瓜花药培养中愈伤组织形成的影响
• 3.5 蔗糖浓度对西瓜花药培养中愈伤组织形成的影响
• 3.6 培养基中的激素浓度对西瓜离体花药培养中愈伤组织形成的影响
• 3.7 高温预培养对西瓜离体花药培养中愈伤组织形成的影响
• 3.8 光暗培养对西瓜离体花药培养中愈伤组织形成的影响
• 3.9 愈伤组织的增殖培养
• 4 西瓜离体小孢子培养研究
• 4.1 供试材料
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 花蕾的消毒与接种
• 4.2.2 小孢子液态培养
• 4.2.3 基本培养条件
• 4.3 试验设计
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 温度处理对小孢子脱分化的影响
• 4.4.2 小孢子培养过程中的形态发生
• 5 讨论
• 6 小结
• 6.1 愈伤组织的诱导
• 6.2 愈伤组织诱导芽分化和生根
• 6.3 游离小孢子培养
• 7 进一步研究的内容
• 参考文献
• 图版及图版说明PLATE AND EXPLANATION
• 作者简介以及攻读硕士学位期间发表的学术论文
• 致谢