NDPK-A及Cys突变体对A549细胞凋亡和氧化还原对其磷酸转移酶活性的影响

论文摘要

目的：对人二磷酸核苷激酶A亚基（NDPK-A）及其四种氧化还原异构体表达纯化，在自然及化学氧化还原环境中，研究NDPK-A及四种Cys突变体的磷酸转移酶活性。构建真核重组载体pEGFP-nm23-H1C145S、pEGFP-nm23-H1C109S，瞬时转染人肺腺癌A549细胞中，将重组载体在真核细胞中表达，研究其诱导肿瘤细胞A549的凋亡活性。方法：在大肠杆菌DH5α中表达NDPK-A基因及其突变体。以DEAE-纤维素弱阴离子交换层析结合Cibacron Blue染料亲和层析技术分别纯化野生型NDPK-A及四种Cys突变体。用HPLC法测定NDPK-A及Cys突变体在自然和化学氧化还原环境下的磷酸基转移酶活性。以pBV220-nm23-H1C145S、pBV220-nm23-H1C109S质粒作为模板，设计合适的引物，进行PCR扩增目的基因，BamH I与EcoR I双酶切后插入pEGFP；将构建成功的重组载体瞬时转染A549细胞后，Western blot方法检测外源目的基因表达水平，流式细胞仪分选绿色荧光表达细胞，测定A549细胞的晚期凋亡率。结果：NDPK-A及突变体在大肠杆菌中高效表达；经纯化分别获得了均一的野生型NDPK-A及突变体蛋白，纯度达到98%；在还原剂（DTT终浓度2.5mM）条件下NDPK-A及突变体的磷酸转移酶活性均高于自然环境下的活性，但在氧化剂H2O2（终浓度0.25mM）条件下的磷酸转移酶活性明显低于自然环境下，且都具有显著性差异。测序鉴定重组载体pEGFP-NDPK-A C145S和pEGFP-NDPK-A C109S成功构建，转染A549细胞后，NDPK-A及其突变体均有表达，并且均能促使A549肿瘤细胞凋亡，凋亡率分别为：41.34±2.55％（NDPK-A），29.77±3.05％（NDPK-AC145S），27.58±4.13％（NDPK-AC109S），突变体NDPK-A C145S，NDPK-A C109S与野生型NDPK-A相比，凋亡率具有显著性差异。结论：氧化还原环境对NDPK-A结构异构及磷酸转移酶活性有一定的影响，这提示氧化还原环境可能调控NDPK-A二硫键的形成,影响蛋白的聚集状态，从而影响蛋白的磷酸转移酶活性。成功构建重组载体pEGFP-NDPK-A C145S、pEGFP-NDPK-A C109S，在A549细胞中均能表达，并且在一定程度上诱导细胞的凋亡。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词表
• 第一章 前言
• 1. nm23-h1/NDPK-A 研究概况
• 2. NDPK-A 磷酸基转移酶活性
• 3. NDPK-A 的氧化还原异构与活性关系
• 4. NDPK-A 的其它生物学活性
• 5. NDPK-A 的应用研究
• 6. 流式细胞仪检测细胞凋亡的原理
• 7. 本研究的目的及意义
• 8. 本研究的创新点
• 9. 技术路线
• 第二章 实验材料与方法
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 第三章 实验结果
• 1.NDPK-A 及 Cys 突变体的诱导表达
• 2. NDPK-A 及 Cys 突变体的纯化
• 3. NDPK-A 及 Cys 突变体磷酸转移酶活性的测定
• 4. 构建 nm23-H1 及 Cys 突变型基因真核重组载体
• 5. NDPK-A 及突变体在真核细胞中的表达
• 6. NDPK-A 及 Cys 突变体对 A549 细胞凋亡的检测
• 第四章 讨论与展望
• 1 讨论
• 2 结论
• 3 展望
• 参考文献
• 附录
• 在校期间发表文章
• 致谢