神经炎症在帕金森病发病机制中的作用

论文摘要

第一部分帕金森病小鼠模型血脑屏障紧密连接蛋白改变以及促红细胞生成素对其影响的研究目的：帕金森病发病机制仍然不甚清楚。帕金森病存在血脑屏障破坏,帕金森病的病理过程至少部分和血脑屏障功能破坏有关,血脑屏障紧密连接蛋白包括ZO-1和occludin可以被基质金属蛋白酶9（MMP9）降解。有些药物抑制基质金属蛋白酶后可以保护多巴胺能神经元丢失。促红细胞生成素可以保护很多中枢神经系统疾病的血脑屏障免受破坏。本实验研究亚急性1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）帕金森病小鼠模型黑质和纹状体ZO-1和occludin的蛋白表达水平以及基质金属蛋白酶（MMP9和MMP2）活性变化。系统注射促红细胞生成素对MMP9、MMP2活性和ZO-1、occludin蛋白表达的影响。方法：雄性C57BL/6小鼠分为4组,第1组腹腔注射等量的PBS一周；第2组腹腔注射重组人促红细胞生成素（5,000 IU/kg/day, i.p.）-周；第3组模型组接受MPTP （20 mg/kg/day）腹腔注射一周,制作亚急性MPTP帕金森病小鼠模型；第4组接受MPTP腹腔注射（20 mg/kg/day, i.p.）一周,在每次注射MPTP之前30分钟腹腔注射重组人促红细胞生成素（5,000 IU/kg/day, i.p.）作为预先干预处理。4组小鼠在末次注射1天后杀鼠取脑。采用明胶酶谱法检测腹侧中脑和纹状体MMP9和MMP2活性,免疫印迹法分析ZO-1和occludin蛋白水平变化。酪氨酸羟化酶和ZO-1免疫组化分别观察中脑黑质多巴胺能神经元丢失及腹侧中脑、纹状体ZO-1表达情况。结果：亚急性MPTP帕金森病模型组小鼠腹侧中脑和纹状体MMP9和MMP2活性增高,ZO-1和occludin蛋白表达水平下降。促红细胞生成素可以降低MMP9和MMP2活性,减少ZO-1和occludin蛋白表达水平下降。帕金森病模型小鼠黑质TH阳性细胞数量减少,促红细胞生成素可以显著缓解TH阳性细胞数量的减少。腹侧中脑和纹状体ZO-1表达在MPTP处理组明显减少,而促红细胞生成素预处理后可明显减缓MPTP的这种效应。结论：帕金森病小鼠模型反映血脑屏障破坏的紧密连接蛋白ZO-1和occludin表达降低伴随着MMP9和MMP2活性升高,这说明血脑屏障破坏可能与MMP9和MMP2活性增高有关。促红细胞生成素的神经保护作用可能与降低MMP9、MMP2活性进而减轻血脑屏障紧密连接蛋白破坏有关。第二部分VCAM-1, CD49d和ICAM-1在帕金森病中表达的研究目的：近年来的研究发现帕金森病动物模型黑质存在CD4+和CD8+淋巴细胞,而且证实CD4+淋巴细胞脑实质浸润促进多巴胺能神经元死亡。经典的淋巴细胞迁移模型需要VCAM-1/VLA-4 （CD49d）、ICAM-1/LFA-1两对受体配体的相互作用。本实验研究帕金森病中粘附分子VCAM-1, CD49d和ICAM-1的表达,以确定这些粘附分子是否在淋巴细胞浸润中发挥作用,以探讨T细胞通过血脑屏障的可能机制。方法：腹腔注射MPTP制作急性（20 mg/kg,4次,每次间隔2 h）帕金森病小鼠模型,模型组小鼠分别在末次注射MPTP 1 d和7d后取脑组织,正常对照组注射等量的PBS。用免疫组织化学染色,观察急性帕金森病小鼠模型中脑CD8阳性淋巴细胞表达情况。用荧光定量PCR或免疫印迹法检测MPTP急性帕金森病小鼠模型腹侧中脑VCAM-1、ICAM-1的表达情况；用流式细胞术检测帕金森病患者和正常人外周血CD4+细胞上VCAM-1的配体VLA-4 （CD49d）的表达情况。结果：急性MPTP帕金森病小鼠模型腹侧中脑存在CD8阳性淋巴细胞。与对照组相比,模型组VCAM-1 mRNA和蛋白表达水平没有明显差异（P>0.05）。与正常对照相比,帕金森病患者CD4+细胞表达VLA-4 （CD49d）没有统计学意义（P>0.05）。帕金森病动物模型腹侧中脑ICAM-1蛋白表达水平明显增高,高于正常对照组小鼠（P<0.05）。结论：ICAM-1在MPTP帕金森病小鼠腹侧中脑表达增高,可能与CD4+淋巴细胞中枢神经系统浸润有关。针对ICAM-1的阻断中和处理有可能减少淋巴细胞浸润,或许可作为一种新的帕金森病治疗措施。第三部分MPTP对C57BL/6小鼠不同脑区中CD14 mRNA. TLR2 mRNA、TLR4 mRNA表达影响的研究目的：本部分实验研究MPTP对C57BL/6小鼠不同脑区中CD 14 mRNA、TLR2 mRNA、TLR4mRNA表达影响。方法：MPTP腹腔注射制作急性和亚急性帕金森病小鼠模型。MPTP 20mg/kg/次,一共注射4次,每次间隔时间为2小时,在一天时间内注射完毕（急性模型剂量和给药）；20 mg/kg/d,每天1次,一共注射7天（亚急性模型剂量和给药）。本实验研究分为四组,8-10周龄对照组、8月龄中年小鼠组、急性模型组、亚急性模型组,6只C57BL/6小鼠随机分配到各组。在末次注射1天后,取所有小鼠不同脑区的组织（腹侧中脑和纹状体）。观察亚急性小鼠模型黑质多巴胺能神经元数目改变情况采用酪氨酸羟化酶（TH）免疫组化方法。用胶质细胞纤维蛋白（GFAP）免疫组织化学染色,观察亚急性小鼠模型腹侧中脑和纹状体中炎性标志细胞-星型胶质细胞改变的情况。用RT-PCR方法检测CD 14 mRNA、TLR4 mRNA以及TLR2 mRNA的表达水平。结果：亚急性小鼠模型黑质TH阳性细胞减少,腹侧中脑和纹状体GFAP阳性细胞明显增多。与正常对照组和中年小鼠组相比,急性和亚急性模型组小鼠黑质和纹状体CD14 mRNA表达水平明显增高（P<0.05）, TLR2 mRNA、TLR4 mRNA的表达各组间没有统计学差异（P>0.05）。结论：本实验显示CD14可能涉及到PD病理进程,进而推测阻断CD14的策略有治疗帕金森病的潜力。MPTP对CD14、TLR2、TLR4表达的影响可能具有时空分布的依赖性。

论文目录

• 前言
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 帕金森病小鼠模型血脑屏障紧密连接蛋白改变以及促红细胞生成素对其影响的研究
• 1. 研究背景
• 2. 材料和方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 参考文献
• 第二部分 VCAM-1,CD49 d和ICAM-1在帕金森病中表达的研究
• 1. 研究背景
• 2. 材料和方法
• 3. 结果
• 4. 讨论
• 参考文献
• 第三部分 MPTP对C57BL/6小鼠不同脑区中CD14 mRNA、TLR2 mRNA、TLR4mRNA表达影响的研究
• 1. 研究背景
• 2. 材料和方法
• 3. 讨论
• 参考文献
• 综述 帕金森病神经炎症的再认识
• 参考文献
• 缩略词表
• 附录
• 致谢