对虾白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体的研制及中和抗体筛选

论文摘要

白斑症病毒（WSSV）病是危害对虾养殖业健康发展的主要疾病之一,十余年来国内外学者已对其进行了大量研究。由于WSSV的囊膜与靶细胞相互作用从而介导病毒对宿主的感染,因此探明这一机理并进而阻断,成为防控WSSV感染的重要途径。本文通过抗WSSV不同囊膜蛋白单克隆抗体的研制,分别获得了抗VP28,VP26及VP19线性表位的单抗;通过WSSV囊膜蛋白单克隆抗体对WSSV的体内与体外中和,筛选得到两株具明显病毒中和作用的抗VP28单抗;应用抗VP28单抗检测分析VP28与宿主细胞的作用关系,论证了其在WSSV感染中的作用;另外,论文通过单抗标记及流式细胞术检测螯虾血细胞内的WSSV,分析了机体感染进程中WSSV对血细胞的感染规律。具体研究内容和结果如下:（1）WSSV囊膜蛋白单抗的研制。差速离心和蔗糖密度梯度离心从对虾鳃组织中分离获得WSSV,之后通过SDS-PAGE、切胶、蛋白洗脱方式分离获得病毒系列蛋白（VP31、VP28、VP26、VP19、以及VP76和VP51左右蛋白）。以获得的病毒蛋白为抗原免疫Balb/C小鼠,采用单克隆抗体技术经细胞融合、筛选、有限稀释法克隆共获得3种抗WSSV囊膜蛋白线性表位的单抗,其中抗VP28单抗8株（1D6、2C8、2G3、2H5、3A6、3E1、4B5、5D2）,抗VP26单抗3株（2D10、3G7、3H9）,抗VP19单抗2株（2C7、2E9）。间接免疫荧光证明各株单抗均与感染WSSV的虾鳃切片呈特异性反应;Western-blot实验证明上述三组单抗所结合的抗原决定簇分别位于WSSV的VP28、VP26以及VP19上;抗体的亚型分析测定结果表明:单抗1D6,2G3,2H5,3A6,3E1,4B5,5D2, 3G7,3H9,2C7和2E9属IgG亚型;单抗2C8和2D10属IgM亚型。（2）单抗对WSSV的体内中和。以克氏原螯虾（Cambarus proclarkii）动物模型检测WSSV各囊膜蛋白单抗的中和效果。从自然感染的对虾组织中粗提WSSV,将病毒液作一定浓度稀释后与单抗1:1孵育2h,之后皮下注射克氏原螯虾（50μl/只）,观察记录螯虾的死亡情况。结果显示2株VP28单抗（1D6,2G3）与病毒混合作用后感染的螯虾组出现死亡的时间（4d,3d）和达到100%死亡率的时间（13d,12d）比对照组（注射未经单抗作用病毒,1d,7d）明显延迟,其他单抗组与对照组相近或稍有提前。结果表明1D6和2G3可明显延缓WSSV对宿主的感染,部分中和了WSSV的感染力。（3）单抗对WSSV的体外中和。通过ELISA实验分析单抗对WSSV与对虾血细胞膜结合的阻断效果验证单抗的中和性。提取中国对虾（Fenneropenaeus chinensis）血细胞膜并对WSSV进行地高辛（DIG）标记,将病毒和各单抗混合作用后吸附对虾血细胞膜,使用抗地高辛抗体检测结合到血细胞膜上的病毒。结果显示单抗1D6,2G3组WSSV的结合量（OD值:0.207,0.235）明显低于对照组（病毒未与单抗作用,OD值:0.401）,其它单抗组与对照组差异不明显。结果表明单抗1D6,2G3可以明显降低WSSV和血细胞膜的结合,通过阻碍WSSV与宿主细胞的结合进而延缓病毒感染,两株单抗均具有部分中和作用。（4）VP28与靶细胞作用关系的分析。中国对虾血细胞与提纯的VP28作用后,应用VP28单抗进行免疫荧光染色,结果显示对虾血细胞与VP28作用后细胞边缘呈现特异性荧光亮点;中国对虾血细胞膜与提纯的VP28作用后,应用VP28单抗进行ELISA实验,结果显示呈现阳性反应;对虾血细胞电泳转移至硝酸纤维素膜,铺覆VP28作用后,应用VP28单抗进行免疫印迹试验,结果显示VP28与中国对虾血细胞膜上的72kDa蛋白结合。以上三项实验均表明洗脱提纯的VP28可与对虾血细胞膜特异性结合,其通过与宿主细胞的黏附作用介导病毒感染,同时推测VP28作用的关键位点为线性结构。（5）WSSV对克氏原螯虾血细胞的感染。通过皮下注射WSSV感染螯虾后每24h收集血细胞,经WSSV单抗及荧光二抗染色后应用流式细胞仪检测,同时记录累积死亡率及血细胞密度。结果显示感染后1-5天:螯虾的累积死亡率为3.3,13.3,16.7,36.7,70.0（%）;血细胞被感染比例为6.47,6.93,10.65,26.08,4.94（%）;被感染细胞平均荧光强度为10.7,10.89,11.71,13.77,15.47;血细胞密度（×106个/ml）为7.56±0.30,5.60±0.24,4.21±0.30,1.45±0.26,1.21±0.21（未感染为5.34±0.22）。以上结果表明,在机体感染进程中,螯虾血细胞密度呈现先升高后下降的趋势,至后期仅为感染前的1/5;血细胞被感染率同时也呈现了先上升后下降的变化趋势,但被感染血细胞中的病毒量则始终呈上升趋势;血细胞处于最高感染率时机体濒临死亡,表明血细胞的WSSV感染程度与机体的感染状况密切相关。综上,本论文在获得WSSV多种囊膜蛋白单克隆抗体的基础上,成功筛选到两株能够明显中和WSSV的单抗,这为进一步应用中和抗体阻断WSSV感染提供了工具;同时,应用VP28单抗表明了提纯的VP28可通过与宿主细胞发生特异性结合作用,为明确WSSV囊膜蛋白在病毒感染中的作用提供了参考和依据;论文的研究结果对WSSV感染机理和防治研究具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 对虾白斑症病毒（WSSV）感染机理的研究进展
• 1.2 对虾白斑症病毒病防控途径的研究现状
• 2 抗白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体的制备
• 2.1 白斑症病毒的提纯
• 2.2 白斑症病毒囊膜蛋白的分离提取
• 2.3 抗白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体的制备
• 2.4 抗白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体的类型鉴定及纯化
• 小结
• 3 抗白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体对病毒的体内中和
• 3.1 白斑症病毒与单克隆抗体的浓度配比
• 3.2 白斑症病毒注射液的体内浓度滴定
• 3.3 螯虾动物模型筛选白斑症病毒的中和单克隆抗体
• 小结
• 4 抗白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体对病毒的体外中和
• 4.1 中国对虾血细胞膜的提取
• 4.2 白斑症病毒的地高辛标记
• 4.3 白斑症病毒与单克隆抗体及对虾血细胞的浓度配比
• 4.4 ELISA 法筛选白斑症病毒的中和单克隆抗体
• 小结
• 5 应用抗VP28 的单克隆抗体分析VP28 与靶细胞的相互作用
• 5.1 VP28 与中国对虾血细胞的相互作用
• 5.2 VP28 与中国对虾血细胞膜的相互作用
• 5.3 中国对虾血细胞膜上VP28 结合蛋白的鉴定
• 小结
• 6 白斑症病毒对克氏原螯虾血细胞的感染
• 6.1 应用白斑症病毒单抗检测克氏原螯虾血细胞内的病毒
• 6.2 螯虾感染白斑症病毒后血细胞的变化
• 小结
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简况及发表文章