减毒沙门氏菌为载体的生长抑素DNA疫苗构建、表达及对草鱼生长影响研究

论文题目: 减毒沙门氏菌为载体的生长抑素DNA疫苗构建、表达及对草鱼生长影响研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物营养学与饲料科学

作者: 戴贤君

导师: 方维焕

关键词: 生长抑素,减毒沙门氏菌,基因免疫,草鱼,生长性能,绿色荧光蛋白基因

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 生长抑素（SS）是由下丘脑释放并作用于生长激素的14肽激素,具有激素和神经递质的双重作用,对SS进行免疫可促进生长类激素释放和提高动物生长速度。但由于SS肽链短而免疫原性较弱,需要同其他载体蛋白连接以增强免疫原性。 随着集约化鱼类养殖业的发展,鱼用疫苗的研究和开发逐渐得到重视,但注射免疫不适于DNA疫苗在规模化鱼类养殖中的推广应用。重组减毒细胞内细菌可作为载体将DNA疫苗递入动物体内,并能激发体液和细胞免疫反应。 本试验将生长抑素基因（SS）同乙肝表面抗原基因（HBsAg）连接,克隆入载体pUC18中,经PCR、酶切和测序分析,重组克隆载体pUC18-HBSS基因已按照设计插入到HBsAg基因3’端的223氨基酸处;进一步将HBSS基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1构建重组原核表达载体pGEX-HBSS并转化大肠杆菌E. coli BL21,含pGEX-HBSS的重组E. coli BL21在37℃经IPTG诱导表达4h,目的蛋白表达量约为细菌总蛋白20%;表达产物经过SS放射免疫法测定表明具有SS活性。 将HBSS基因克隆入的真核表达质粒pcDNA3构建重组质粒pcDNA3-HBSS,重组质粒通过高压电转化入减毒沙门氏菌Salmonella typhimurium ZJ111（dam- and phop-）（简称ZJ111/pcDNA3-HBSS,下同）,通过PCR、酶切检测表明重组减毒沙门氏菌构建成功,在Amp+和Amp-的平板上培养10代表明重组质粒在沙门氏菌中较为稳定。将重组沙门氏菌转染HeLa细胞48h,从细胞中提取总RNA经RT-PCR检测发现,HBSS基因能在细胞中转录出RNA;转染72h后,SDS-PAGE检测到有目的蛋白表达;放射免疫测定表明,转染含pcDNA3-HBSS质粒的重组减毒沙门氏菌的细胞培养物裂解上清液中含SS 1.363μg/mL,HBSS基因在HeLa细胞中得到了表达,并具有较高的活性。 将ZJ111/pcDNA3-SS灌服草鱼,检验其侵袭力和侵入草鱼体内过程中质粒的稳定性。给幼草鱼灌服108cfu/ml、109cfu/ml、1010cfu/ml的ZJ111/pcDNA3-SS以检验其对鱼的安全性,另设野生型鼠伤寒沙门氏菌（109cfu/ml）和PBS对照组,试验期20天,观察并比较各组死亡率。另取150克左右的草鱼灌服PBS、108cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS和108cfu/ml野生型鼠伤寒沙门氏菌组,7天后屠宰取肝和脾脏,做透射电镜切片观察。结果显示,对草鱼肝脏和脾脏分离菌的生化和特异性PCR鉴定表明,ZJ111/pcDNA3-HBSS能侵入草鱼体内;灌服7天后草鱼肝、脾脏分离的减毒菌抽提重组质粒进行PCR和酶切鉴定表明,减毒菌中的重组质粒在草鱼体内有较好的稳定性;灌服109cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS的幼鱼在试验期间有2尾死亡,108cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS和PBS的幼鱼采食和生长正常,灌服1010cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS和野生型S. typhimurium的幼鱼死亡率分别为26.67%、76.67%。灌服108cfu/ml ZJ111/DcDNA3-HBSS的草鱼肝、脾细胞形态正常,肝脏线粒体略微

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 文献综述

第一章 生长抑素在鱼类生长中的作用及其免疫调控

1 生长抑素

1.1 生长抑素的特性及其在动物体内的生理功能

1.2 生长抑素受体

1.3 生长抑素体内作用机制

2 鱼类生长抑素的多样性

3 SS对生长鱼类的作用

3.1 SS对鱼类生长的影响

3.2 SS对鱼类垂体分泌的调节

3.3 鱼类SS在垂体外的作用

4 SS同鱼类繁殖和代谢的相互作用

4.1 SS对鱼类繁殖的作用

4.2 SS同代谢的相互作用

5 动物生长抑素的调控研究

5.1 半胱胺(CSH)对动物生长抑素的调控

5.2 生长抑素的免疫调控

6 鱼类生长抑素的调控研究

第二章 鱼类DNA疫苗的研究进展

1 鱼类疫苗的发展

2 鱼类DNA疫苗及其构建

2.1 DNA疫苗预防鱼类疾病的优势

2.2 鱼类DNA疫苗的构建

2.3 鱼类DNA疫苗目的基因的表达

3 鱼类DNA疫苗的作用机理

3.1 鱼类DNA疫苗肌肉免疫的抗原呈递

3.2 鱼类DNA疫苗经黏膜和皮肤免疫的抗原呈递

4 鱼类DNA疫苗的接种方式

4.1 注射免疫

4.2 基因枪接种

4.3 浸泡免疫

4.4 减毒菌为载体介导DNA疫苗的接种

5 以减毒菌为载体的DNA疫苗研究

5.1 减毒菌为载体的DNA疫苗的优点

5.2 革兰氏阴性菌传递DNA疫苗

5.3 革兰氏阳性菌传递DNA疫苗

6 鼠伤寒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究

6.1 减毒沙门氏菌侵入机体途径

6.2 沙门氏菌的基因工程减毒

6.3 减毒沙门氏菌作为载体的DNA疫苗效果

6.4 鼠伤寒沙门氏菌对鱼的致病性

7 鱼类DNA疫苗的未来发展

7.1 优化和调整表达质粒

7.2 提高DNA疫苗的免疫效果

7.3 调整目的基因表达的可控性

7.4 评估DNA疫苗的生物安全性

7.5 探索合适的疫苗接种时间

第二部分 研究内容

第一章 生长抑素基因的原核表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章 生长抑素基因真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 减毒沙门氏菌为载体的生长抑素DNA疫苗对草鱼的稳定性和安全性

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 减毒沙门氏菌为载体的绿色荧光蛋白在草鱼体内的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第五章 减毒沙门氏菌为载体的生长抑素DNA疫苗对草鱼生长的影响及其机理研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 本研究的创新点

附录一 致谢

附录二发表及录用的论文

发布时间: 2005-07-27

参考文献

• [1].减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究[D]. 黄凌远.四川农业大学2014

相关论文

• [1].猪链球菌溶血素基因的克隆及其原核和真核表达[D]. 马有智.浙江大学2003
• [2].表达绿色荧光蛋白的重组减毒鼠伤寒沙门氏菌及其免疫生物学特性[D]. 王芳.扬州大学2002
• [3].重组减毒细菌运送CD8～+T细胞表位的机理及携带新城疫病毒DNA 疫苗鼠伤寒沙门氏菌的免疫生物学特性研究[D]. 潘志明.扬州大学2004
• [4].鸡IL-2、IL-18、IFN-γ和CpG DNA在减毒沙门氏菌运送H5亚型禽流感核酸疫苗中的佐剂作用及鸡CD4和CD8分子单克隆抗体的研制[D]. 胡青海.扬州大学2005
• [5].减毒沙门氏菌为载体的原核与真核表达和鸡新城疫病毒表面糖蛋白基因免疫研究[D]. John M.Dikki.浙江大学2005
• [6].用RNA干扰（RNAi）抗草鱼出血病病毒的初步研究[D]. 陈芸.中国科学院研究生院（水生生物研究所）2005
• [7].以减毒沙门氏菌携带共表达siRNA-Stat3及GRIM-19质粒抗前列腺癌的体内外实验研究[D]. 张灵.吉林大学2006
• [8].柱状黄杆菌胞外和外膜蛋白及草鱼鳃粘液的蛋白质组学研究[D]. 刘国勇.中国科学院研究生院（水生生物研究所）2006
• [9].核酸佐剂GM-CSF的克隆及其对生长抑素DNA疫苗的免疫增强作用[D]. 舒邓群.南京农业大学2006
• [10].减毒沙门氏菌介导的冠状病毒基因疫苗及其免疫生物学特性[D]. 焦红梅.扬州大学2006

标签：生长抑素论文;  减毒沙门氏菌论文;  基因免疫论文;  草鱼论文;  生长性能论文;  绿色荧光蛋白基因论文;