减毒沙门氏菌为载体的生长抑素DNA疫苗构建、表达及对草鱼生长影响研究

减毒沙门氏菌为载体的生长抑素DNA疫苗构建、表达及对草鱼生长影响研究

论文题目: 减毒沙门氏菌为载体的生长抑素DNA疫苗构建、表达及对草鱼生长影响研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 动物营养学与饲料科学

作者: 戴贤君

导师: 方维焕

关键词: 生长抑素,减毒沙门氏菌,基因免疫,草鱼,生长性能,绿色荧光蛋白基因

文献来源: 浙江大学

发表年度: 2005

论文摘要: 生长抑素(SS)是由下丘脑释放并作用于生长激素的14肽激素,具有激素和神经递质的双重作用,对SS进行免疫可促进生长类激素释放和提高动物生长速度。但由于SS肽链短而免疫原性较弱,需要同其他载体蛋白连接以增强免疫原性。 随着集约化鱼类养殖业的发展,鱼用疫苗的研究和开发逐渐得到重视,但注射免疫不适于DNA疫苗在规模化鱼类养殖中的推广应用。重组减毒细胞内细菌可作为载体将DNA疫苗递入动物体内,并能激发体液和细胞免疫反应。 本试验将生长抑素基因(SS)同乙肝表面抗原基因(HBsAg)连接,克隆入载体pUC18中,经PCR、酶切和测序分析,重组克隆载体pUC18-HBSS基因已按照设计插入到HBsAg基因3’端的223氨基酸处;进一步将HBSS基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1构建重组原核表达载体pGEX-HBSS并转化大肠杆菌E. coli BL21,含pGEX-HBSS的重组E. coli BL21在37℃经IPTG诱导表达4h,目的蛋白表达量约为细菌总蛋白20%;表达产物经过SS放射免疫法测定表明具有SS活性。 将HBSS基因克隆入的真核表达质粒pcDNA3构建重组质粒pcDNA3-HBSS,重组质粒通过高压电转化入减毒沙门氏菌Salmonella typhimurium ZJ111(dam- and phop-)(简称ZJ111/pcDNA3-HBSS,下同),通过PCR、酶切检测表明重组减毒沙门氏菌构建成功,在Amp+和Amp-的平板上培养10代表明重组质粒在沙门氏菌中较为稳定。将重组沙门氏菌转染HeLa细胞48h,从细胞中提取总RNA经RT-PCR检测发现,HBSS基因能在细胞中转录出RNA;转染72h后,SDS-PAGE检测到有目的蛋白表达;放射免疫测定表明,转染含pcDNA3-HBSS质粒的重组减毒沙门氏菌的细胞培养物裂解上清液中含SS 1.363μg/mL,HBSS基因在HeLa细胞中得到了表达,并具有较高的活性。 将ZJ111/pcDNA3-SS灌服草鱼,检验其侵袭力和侵入草鱼体内过程中质粒的稳定性。给幼草鱼灌服108cfu/ml、109cfu/ml、1010cfu/ml的ZJ111/pcDNA3-SS以检验其对鱼的安全性,另设野生型鼠伤寒沙门氏菌(109cfu/ml)和PBS对照组,试验期20天,观察并比较各组死亡率。另取150克左右的草鱼灌服PBS、108cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS和108cfu/ml野生型鼠伤寒沙门氏菌组,7天后屠宰取肝和脾脏,做透射电镜切片观察。结果显示,对草鱼肝脏和脾脏分离菌的生化和特异性PCR鉴定表明,ZJ111/pcDNA3-HBSS能侵入草鱼体内;灌服7天后草鱼肝、脾脏分离的减毒菌抽提重组质粒进行PCR和酶切鉴定表明,减毒菌中的重组质粒在草鱼体内有较好的稳定性;灌服109cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS的幼鱼在试验期间有2尾死亡,108cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS和PBS的幼鱼采食和生长正常,灌服1010cfu/ml ZJ111/pcDNA3-HBSS和野生型S. typhimurium的幼鱼死亡率分别为26.67%、76.67%。灌服108cfu/ml ZJ111/DcDNA3-HBSS的草鱼肝、脾细胞形态正常,肝脏线粒体略微

论文目录:

中文摘要

英文摘要

前言

第一部分 文献综述

第一章 生长抑素在鱼类生长中的作用及其免疫调控

1 生长抑素

1.1 生长抑素的特性及其在动物体内的生理功能

1.2 生长抑素受体

1.3 生长抑素体内作用机制

2 鱼类生长抑素的多样性

3 SS对生长鱼类的作用

3.1 SS对鱼类生长的影响

3.2 SS对鱼类垂体分泌的调节

3.3 鱼类SS在垂体外的作用

4 SS同鱼类繁殖和代谢的相互作用

4.1 SS对鱼类繁殖的作用

4.2 SS同代谢的相互作用

5 动物生长抑素的调控研究

5.1 半胱胺(CSH)对动物生长抑素的调控

5.2 生长抑素的免疫调控

6 鱼类生长抑素的调控研究

第二章 鱼类DNA疫苗的研究进展

1 鱼类疫苗的发展

2 鱼类DNA疫苗及其构建

2.1 DNA疫苗预防鱼类疾病的优势

2.2 鱼类DNA疫苗的构建

2.3 鱼类DNA疫苗目的基因的表达

3 鱼类DNA疫苗的作用机理

3.1 鱼类DNA疫苗肌肉免疫的抗原呈递

3.2 鱼类DNA疫苗经黏膜和皮肤免疫的抗原呈递

4 鱼类DNA疫苗的接种方式

4.1 注射免疫

4.2 基因枪接种

4.3 浸泡免疫

4.4 减毒菌为载体介导DNA疫苗的接种

5 以减毒菌为载体的DNA疫苗研究

5.1 减毒菌为载体的DNA疫苗的优点

5.2 革兰氏阴性菌传递DNA疫苗

5.3 革兰氏阳性菌传递DNA疫苗

6 鼠伤寒沙门氏菌作为DNA疫苗载体的研究

6.1 减毒沙门氏菌侵入机体途径

6.2 沙门氏菌的基因工程减毒

6.3 减毒沙门氏菌作为载体的DNA疫苗效果

6.4 鼠伤寒沙门氏菌对鱼的致病性

7 鱼类DNA疫苗的未来发展

7.1 优化和调整表达质粒

7.2 提高DNA疫苗的免疫效果

7.3 调整目的基因表达的可控性

7.4 评估DNA疫苗的生物安全性

7.5 探索合适的疫苗接种时间

第二部分 研究内容

第一章 生长抑素基因的原核表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二章 生长抑素基因真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三章 减毒沙门氏菌为载体的生长抑素DNA疫苗对草鱼的稳定性和安全性

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第四章 减毒沙门氏菌为载体的绿色荧光蛋白在草鱼体内的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第五章 减毒沙门氏菌为载体的生长抑素DNA疫苗对草鱼生长的影响及其机理研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 本研究的创新点

附录一 致谢

附录二发表及录用的论文

发布时间: 2005-07-27

参考文献

  • [1].减毒沙门氏菌介导的罗非鱼源无乳链球菌sip基因口服核酸疫苗的研究[D]. 黄凌远.四川农业大学2014

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