论文摘要
铬（Ⅲ）是哺乳动物体内维持糖代谢、脂代谢平衡的重要微量元素。已有研究表明，铬（Ⅲ）能增强胰岛素的作用，在有外加胰岛素时能刺激细胞对葡萄糖的摄取。临床医学研究表明，给糖尿病人补充适量铬配合物能增强胰岛素作用，缓解人体受损的葡萄糖耐量，血糖水平降低，血清胆固醇下降。细胞铬是通过增强“胰岛素受体”酪氨酸激酶活性而敏化了胰岛素信号。营养或药理学补充铬有助于降低患Ⅱ型糖尿病的危险。要彻底解释铬的生理作用机制，还有许多基本问题没有解决，如生理条件下铬的存在形式是什么?铬在血液中各蛋白质分子间是如何交换的?铬的运输是否具有专一性?铬化合物如何跨细胞膜，其结构与活性间的关系是什么?距离理解铬的生物化学及其分子机制还有很大距离。本论文以合成水杨酸系列铬（Ⅲ）配合物为出发点，在明晰其基本理化性质的基础上，探讨了铬（Ⅲ）配合物与人血清白蛋白和转铁蛋白结合的热力学和动力学性质，研究了由转铁蛋白受体介导的细胞内吞过程吸收铬（Ⅲ）的作用机制，由铬（Ⅲ）配合物对pBR322 DNA、血清蛋白质的断裂实验考察了铬（Ⅲ）配合物的毒性。主要内容如下：第一章综述。本章阐述了有关铬（Ⅲ）的生物功能研究的最新进展。对哺乳动物来说铬是一种重要的微量元素，是维持体内正常的糖代谢和脂代谢所必需的。但是，从分子水平评价铬的生物功能仍然是目前生物化学家面临的主要挑战之一。第二章水杨酸系列铬配合物的合成及表征。一个世纪以前，高剂量的水杨酸盐被用来减轻Ⅱ型糖尿病的症状。早已证明水杨酸是蛋白质酪氨酸磷酸酯酶PTP1B酶的弱的抑制剂，抑制浓度为19．4 mmol·L-1。近来，许多实验室报道了包含两个水杨酸单体的聚合类物质是PTP酶潜在的抑制剂。在老鼠模型中，甲基水杨酸衍生物被证明有减肥效应，能降低血液甘油三酸脂、胆固醇和脂肪酸的浓度。本章选择水杨酸及其衍生物作为配体与铬（Ⅲ）发生化合反应，生成系列新的铬（Ⅲ）化合物，如[Cr（Ⅲ）（SA）（en）2]Cl、Cr（Ⅲ）（SSA）（en）2、[Cr（Ⅲ）（4-ASA）（en）2]Cl、[Cr（Ⅲ）（HNA）（en）2]Cl、[Cr2（CH2SA2）（en）4]Cl2和[Cr2（CH2NSA2）（en）4]Cl2等，(en=ethylenediamine，SA=salicylic acid，SSA=5-sulfosalicylic acid，4-ASA=4-aminosalicylic acid，HNA=3-Hydroxy-2-naphthoic acid，CH2NSA=4，4’-Methylenebis（3-Hydroxy-2-naphthoic acid）。通过元素分析、荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、电导率测定、X-射线晶体衍射等方法对配合物结构进行了表征。结果表明，铬与来自水杨酸的羧基氧、酚羟基氧和两个乙二氨配体上的四个氮原子配位，形成六配位八面体结构。水杨酸在配位前后光谱变化十分明显：配位后特征紫外吸收峰由298 nm红移至326 nm；水杨酸在410 nm处具有强的荧光发射峰，配位后荧光发射峰基本消失。较大的光谱变化有助于对配合物的反应性等进行光谱跟踪。第三章水杨酸系列铬配合物的理化性质研究。六配位八面体结构铬（Ⅲ）配合物通常比较稳定，属于惰性配合物。其光化学反应性是无机化学等领域的重要研究方向。本章利用荧光光谱、紫外-可见吸收光谱、电导率测定、pH测定、电喷雾质谱等方法研究了所合成的铬配合物的理化性质，包括配合物的热稳定性、酸碱稳定性、光稳定性等，重点是光照条件下配合物溶液的变化。研究表明，配合物在常温下，中性溶液中稳定，在酸性溶液中缓慢分解；在光照条件下易发生光化学反应，乙二胺分子会因质子化而被两个水分子取代，最终形成由水分子桥连的多核铬-水杨酸聚合物。利用配合物及其光照产物分别与EDTA的动力学竞争反应和配合物对双氧水的稳定性实验，表明铬配合物经光化学反应后稳定性降低。第四章铬（Ⅲ）配合物与人血清白蛋白的相互作用。血清白蛋白为不含糖的单肽链蛋白质，等电点为4．6，由585个氨基酸残基组成，分子量为66500。作为血清中含量最高的蛋白质，它对保持血压、小分子化合物的输运、调节等起重要的作用。因此，血清白蛋白可与许多底物结合，如金属离子(Cu2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+)、脂肪酸、氨基酸、激素、药物等。研究铬配合物与人血清白蛋白的作用对营养铬的生物存在形式、作用机理具有重要意义。本章利用荧光光谱研究了四种铬（Ⅲ）配合物与人血清白蛋白的作用。这些配合物均淬灭人血清白蛋白色氨酸残基的荧光。根据荧光淬灭理论，分别求取了[Cr（SA）（en）2]Cl、[Cr（4-ASA）（en）2]Cl、[Cr（SSA）（en）2]、[Cr（HNA）（en）2]Cl与蛋白的结合常数，分别为8．70×103，1．69×104，7．40×103、2．80×104mol-1·L。利用紫外-可见吸收光谱和荧光光谱对HSA与配合物所形成的复合物稳定性进行了监测。研究表明配合物在此复合物中能稳定存在。按Forester偶极-偶极无辐射能量转移机理，分别求取了配合物与HSA 214位色氨酸残基的距离。计算了配合物与蛋白作用的热力学参数，参照Ross的经验公式，分析了配合物与人血清白蛋白分子间的作用力，推断为疏水作用、静电引力和氢键等分子间作用力共同作用的结果。第五章：铬配合物与伴清蛋白反应动力学。到目前为止，铬在肠道中的吸收机理还不清楚。体内外的研究表明转铁蛋白与铬的吸收、转运过程有关。本章利用荧光光谱和紫外-可见吸收光谱分别研究了铬从配合物[Cr（SA）（en）2]Cl等向小分子竞争剂EDTA和伴清蛋白（Apoovotransferrin）转移的动力学行为。分别求取了他们的二级反应速率常数。结果表明，二者的转移方式不同。EDTA可使铬配合物完全转化为Cr-EDTA配合物；而铬从配合物向伴清蛋白转移时，Cr-en键断裂，Cr（SA）作为整体与蛋白键合形成[Cr（SA）]-OTf三元复合物。在此三元化合物中，水杨酸根离子起到了类似碳酸根离子的伴阴离子作用，4-氨基水杨酸根和5-磺基水杨酸根离子也具有类似的作用，而3-羟基-2-萘甲酸根离子可能因为分子体积大而不能做伴阴离子。生理条件下铬从[Cr（Ⅲ）（SA）（en）2]Cl向伴清蛋白的转移是比较慢的，k=（1．4±0．2）×10-1mol-1·L·s-1。第六章：K562细胞转铁蛋白受体介导铬（Ⅲ）转运机制。本章以K562细胞为模型，利用125I标记转铁蛋白，研究了脱铁转铁蛋白（apoTf）、Cr-Tf和Cr2-Tf与K562细胞的结合、内吞与释放过程，阐述了K562细胞吸收铬（Ⅲ）一转铁蛋白的作用机制。研究表明三个物种与受体的结合能力大小次序为apoTf<Cr-Tf<Cr2-Tf；细胞对Cr-Tf和Cr2-Tf以相似的速率进行内吞，两者的内吞速率大于apoTf;Cr-Tf和Cr2-Tf经内吞后apoTf被释放到胞外，这两个物种相对apoTf有拖延的循环过程。未标记的冷apoTf的介入促进Cr-Tf的释放，且与介入的apoTf的量有关，受体占有率可能对循环起着驱动作用；抑制剂NaN3和NH4Cl阻止了Cr-Tf的释放；抑制剂NaN3的存在，影响Cr-Tf与细胞的结合与释放，表明两个过程都需要代谢能；过量冷的未标记apoTf的加入能克服由NH4Cl阻止Cr-Tf的释放，而不能克服由NaN3阻止Cr-Tf的释放；该研究有助于理解铬在体内的转运机制，为铬化合物治疗糖尿病药物的研发提供理论依据。第七章：系列铬配合物对核酸和蛋白质损伤的研究。铬对DNA的损害，包括链的断裂、端的去除和Cr（Ⅲ）-DNA铰链的形成是由铬诱导的癌变的主要成因。为了考察所合成的铬配合物的毒性，本章分别研究了水杨酸系列铬配合物对核酸和白蛋白的损伤，具体结果如下：1、利用琼脂糖凝胶电泳技术在生理条件下研究了系列铬配合物在光照前后分别对pBR322 DNA的切割。研究表明铬配合物[Cr（Ⅲ）（SA）（en）2]Cl、Cr（Ⅲ）（SSA）（en）2、[Cr（Ⅲ）（4-ASA）（en）2]Cl在实验浓度下和指定时间内不能断裂DNA；但是，这三种配合物的光照产物断裂DNA的实验证明：三个光照产物均能在低浓度下(6μmol·L-1)和极短时间内能将DNA断裂成大量碎片。铬配合物的光照产物在避光条件下比较稳定，在一年后仍具有较强的切割DNA的能力。经过外加羟基自由基捕捉剂的对比实验和线性DNA（切割产物）的连接等实验，初步推测切割机理为水解切割。2、SDS-PAGE电泳实验表明在生理条件下铬配合物不能断裂白蛋白。即使在双氧水存在下，铬配合物也不能断裂白蛋白。对上述体系的蛋白质的吸收光谱监测也表明，蛋白质的三级结构没有发生改变。