棉铃虫中肠APN活力测定及Bt毒素受体APN1的表达纯化

棉铃虫中肠APN活力测定及Bt毒素受体APN1的表达纯化

论文摘要

转Bt基因抗虫棉是我国棉花害虫综合防治的重要手段之一,转Bt基因棉花种植面积的快速增长,使其主要靶标昆虫棉铃虫Helicoverpa armigera存在产生抗性的风险。一旦棉铃虫对Bt转基因棉花产生抗性,会威胁各种Bt制剂、转Bt基因棉花和其他Bt作物的使用寿命。棉铃虫Bt抗性机理的研究是抗性监测、风险预测和抗性治理的基础,对于合理、有效使用Bt,延长转Bt基因棉使用寿命有重要的意义。氨肽酶N(Aminopeptidase N)已被确认为多种昆虫中肠Bt毒蛋白在的主要受体,但APN与昆虫Bt抗性产生的关系还存在很多争议,重组棉铃虫APN蛋白对其功能进行研究对棉铃虫Bt抗性机制的研究有重要意义。本研究利用本实验室筛选的棉铃虫Bt试剂敏感品系96S和抗性品系品系BtR,分别克隆幼虫中肠氨肽酶N1(APN1)基因的去信号肽片断,比较预测氨基酸序列得知:APN1/BtR有1个氨基酸缺失,即45苏氨酸缺失,5个氨基酸发生突变,即194苏氨酸→丝氨酸,550缬氨酸→异亮氨酸,861异亮氨酸→苏氨酸,902丙氨酸→脯氨酸,954苏氨酸→脯氨酸。本研究采取了Bac to Bac表达系统,分别对APN1/96S和APN1/BtR重组表达,该系统具有高效表达,翻译后修饰,无内毒素污染等优势。将APN1克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTb,将重组质粒pFastBacHTb-APN1转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,发生体内重组,获得杆粒Bacmid-APN1。杆粒DNA在脂质体Lipofectin介导下侵染粉纹夜蛾Trichoplusia ni细胞(Tn-5B1-4),获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,表达目的蛋白。SDS-PAGE分析和Ligand blot配体杂交显示,目的蛋白成功表达,重组蛋白APN1/96S和APN1/BtR在变性条件下均能与Cry1Ac毒素结合。测定病毒滴度,以MOI=3.0大量感染并收获细胞,由于重组蛋白带有His-tag标记,细胞破碎后,采用HisTrap Ni离子亲和层析柱纯化重组蛋白,Ni离子亲和层析柱吸附His-tag标记蛋白,以高浓度咪唑洗脱结合蛋白。SDS-PAGE分析和Ligandblot配体杂交显示,成功纯化重组蛋白。本研究通过比较棉铃虫敏感、抗性品系幼虫中肠前部和后部BBMV中APN活力,验证APN的活力是否与昆虫Bt抗性相关。结果表明APN活力在中肠前部和后部的分布符合APN作为Bt毒素受体的功能,但敏感、抗性的幼虫之间中肠各部的APN活力没有显著差异。为APN活力与昆虫Bt抗性,APN在昆虫Bt抗性中的作用的研究提供实验依据。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 引言
  • 1.2 BT的杀虫机理
  • 1.3 昆虫BT抗性机制的研究进展
  • 1.3.1 昆虫抗性品系的筛选
  • 1.3.2 昆虫Bt抗性的生化基础
  • 1.3.2.1 水解过程的改变
  • 1.3.2.2 结合位点的改变
  • 1.3.2.3 其他生化抗性机制
  • 1.3.3 Bt抗性的遗传基础
  • 1.3.3.1 Bt抗性遗传方式的研究
  • 1.3.3.2 遗传分析的方法
  • 1.3.3.3 鉴定抗性相关的基因
  • 1.4 受体蛋白的种类及作用
  • 1.4.1 氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)
  • 1.4.2 类钙粘蛋白(Cadherin-like protein)
  • 1.4.3 其他受体蛋白
  • 1.5 受体蛋白的表达及功能研究
  • 1.5.1 APN的异源细胞表达
  • 1.5.2 类钙粘蛋白的异源细胞表达
  • 1.6 杆状病毒载体表达系统
  • 1.6.1 昆虫杆状病毒表达系统的优缺点
  • 1.6.2 Bac to Bac表达系统的原理
  • 1.6.3 昆虫杆状病毒表达系统的发展
  • 1.6.3.1 BaculoDirect Express System
  • 1.6.3.2 家蚕核型多角体病毒—家蚕表达系统
  • 第二章 本研究的内容和意义
  • 2.1 研究内容
  • 2.1.1 棉铃虫敏感、抗性品系的APN1基因的克隆
  • 2.1.2 棉铃虫敏感、抗性品系的APN1在Tn细胞中的表达
  • 2.1.3 重组棉铃虫敏感、抗性品系的APN1的纯化
  • 2.1.4 棉铃虫敏感、抗性品系APN活力测定
  • 2.2 技术路线
  • 2.2.1 棉铃虫APN1在Tn细胞中的表达及纯化技术路线
  • 2.2.2 棉铃虫敏感、抗性品系APN活力的测定技术路线
  • 2.3 研究目的与意义
  • 第三章 棉铃虫敏感、抗性品系APN1基因克隆
  • 3.1 材料与方法
  • 3.1.1 实验材料
  • 3.1.1.1 供试昆虫
  • 3.1.1.2 引物设计与合成
  • 3.1.1.3 酶与试剂
  • 3.1.1.4 菌株、质粒和细胞
  • 3.1.1.5 培养基
  • 3.1.1.6 主要仪器
  • 3.1.1.7 常用储存液与缓冲液
  • 3.1.2 试验方法
  • 3.1.2.1 RNA的提取
  • 3.1.2.2 反转录
  • 3.1.2.3 APN1的扩增
  • 3.1.2.4 PCR产物的回收纯化
  • 3.1.2.5 TA克隆
  • 3.1.2.6 转化DH5α
  • 3.1.2.7 质粒DNA的提取
  • 3.1.2.8 检测
  • 3.1.2.9 序列测定
  • 3.2 试验结果
  • 3.2.1 棉铃虫敏感、抗性品系APN1基因克隆
  • 3.2.2 APN1基因序列分析
  • 3.3 讨论
  • 第四章 棉铃虫敏感、抗性品系APN1在TN细胞中表达
  • 4.1 材料与方法
  • 4.1.1 试验材料
  • 4.1.1.1 酶与试剂
  • 4.1.1.2 菌株、质粒和细胞
  • 4.1.1.3 培养基
  • 4.1.1.4 主要仪器
  • 4.1.1.5 常用储存液与缓冲液
  • 4.1.2 试验方法
  • 4.1.2.1 重组转移载体的构建
  • 4.1.2.2 重组杆粒的提取与鉴定
  • 4.1.2.3 细胞培养
  • 4.1.2.4 共转染与感染
  • 4.1.2.5 重组蛋白的表达
  • 4.2 试验结果
  • 4.2.1 重组转移质粒构建与鉴定
  • 4.2.2 重组杆状病毒DNA Bacmid的鉴定
  • 4.2.3 重组蛋白表达与鉴定及病毒的滴度测定
  • 4.2.3.1 细胞形态反应
  • 4.2.3.2 滴度测定
  • 4.2.3.3 SDS-PAGE结果
  • 4.2.3.4 Ligand blot结果
  • 4.3 讨论
  • 4.3.1 表达系统的选择
  • 4.3.2 重组棉铃虫敏感、抗性品系APN1蛋白与毒素的结合能力
  • 第五章 重组棉铃虫敏感、抗性品系APN1的纯化
  • 5.1 材料与方法
  • 5.1.1 试验材料
  • 5.1.1.1 试剂和酶
  • 5.1.1.2 主要仪器
  • 5.1.1.3 常用储存液与缓冲液
  • 5.1.2 试验方法
  • 5.1.2.1 样品的制备
  • 5.1.2.2 Ni离子亲和层析
  • 5.1.2.3 透析
  • 5.2 试验结果
  • 5.3 讨论
  • 第六章 棉铃虫敏感、抗性品系APN活力测定
  • 6.1 材料与方法
  • 6.1.1 试验材料
  • 6.1.1.1 供试昆虫
  • 6.1.1.2 酶与试剂
  • 6.1.1.3 常用储存液与缓冲液
  • 6.1.2 试验方法
  • 6.1.2.1 BBMV的提取
  • 6.1.2.2 蛋白浓度测定
  • 6.1.2.3 APN活性的测定
  • 6.2 试验结果
  • 6.3 讨论
  • 第七章 小结
  • 7.1 棉铃虫敏感、抗性品系的APN1基因的克隆
  • 7.2 棉铃虫敏感、抗性品系的APN1在TN细胞中的表达
  • 7.3 重组棉铃虫敏感、抗性品系的APN1的纯化
  • 7.4 棉铃虫敏感、抗性品系APN活力测定
  • 参考文献
  • 致谢
  • 附录
  • 相关论文文献

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