论文摘要
转Bt基因抗虫棉是我国棉花害虫综合防治的重要手段之一,转Bt基因棉花种植面积的快速增长,使其主要靶标昆虫棉铃虫Helicoverpa armigera存在产生抗性的风险。一旦棉铃虫对Bt转基因棉花产生抗性,会威胁各种Bt制剂、转Bt基因棉花和其他Bt作物的使用寿命。棉铃虫Bt抗性机理的研究是抗性监测、风险预测和抗性治理的基础,对于合理、有效使用Bt,延长转Bt基因棉使用寿命有重要的意义。氨肽酶N(Aminopeptidase N)已被确认为多种昆虫中肠Bt毒蛋白在的主要受体,但APN与昆虫Bt抗性产生的关系还存在很多争议,重组棉铃虫APN蛋白对其功能进行研究对棉铃虫Bt抗性机制的研究有重要意义。本研究利用本实验室筛选的棉铃虫Bt试剂敏感品系96S和抗性品系品系BtR,分别克隆幼虫中肠氨肽酶N1(APN1)基因的去信号肽片断,比较预测氨基酸序列得知:APN1/BtR有1个氨基酸缺失,即45苏氨酸缺失,5个氨基酸发生突变,即194苏氨酸→丝氨酸,550缬氨酸→异亮氨酸,861异亮氨酸→苏氨酸,902丙氨酸→脯氨酸,954苏氨酸→脯氨酸。本研究采取了Bac to Bac表达系统,分别对APN1/96S和APN1/BtR重组表达,该系统具有高效表达,翻译后修饰,无内毒素污染等优势。将APN1克隆至杆状病毒转移载体pFastBacHTb,将重组质粒pFastBacHTb-APN1转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,发生体内重组,获得杆粒Bacmid-APN1。杆粒DNA在脂质体Lipofectin介导下侵染粉纹夜蛾Trichoplusia ni细胞(Tn-5B1-4),获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,表达目的蛋白。SDS-PAGE分析和Ligand blot配体杂交显示,目的蛋白成功表达,重组蛋白APN1/96S和APN1/BtR在变性条件下均能与Cry1Ac毒素结合。测定病毒滴度,以MOI=3.0大量感染并收获细胞,由于重组蛋白带有His-tag标记,细胞破碎后,采用HisTrap Ni离子亲和层析柱纯化重组蛋白,Ni离子亲和层析柱吸附His-tag标记蛋白,以高浓度咪唑洗脱结合蛋白。SDS-PAGE分析和Ligandblot配体杂交显示,成功纯化重组蛋白。本研究通过比较棉铃虫敏感、抗性品系幼虫中肠前部和后部BBMV中APN活力,验证APN的活力是否与昆虫Bt抗性相关。结果表明APN活力在中肠前部和后部的分布符合APN作为Bt毒素受体的功能,但敏感、抗性的幼虫之间中肠各部的APN活力没有显著差异。为APN活力与昆虫Bt抗性,APN在昆虫Bt抗性中的作用的研究提供实验依据。
论文目录
摘要ABSTRACT第一章 文献综述1.1 引言1.2 BT的杀虫机理1.3 昆虫BT抗性机制的研究进展1.3.1 昆虫抗性品系的筛选1.3.2 昆虫Bt抗性的生化基础1.3.2.1 水解过程的改变1.3.2.2 结合位点的改变1.3.2.3 其他生化抗性机制1.3.3 Bt抗性的遗传基础1.3.3.1 Bt抗性遗传方式的研究1.3.3.2 遗传分析的方法1.3.3.3 鉴定抗性相关的基因1.4 受体蛋白的种类及作用1.4.1 氨肽酶N(Aminopeptidase N,APN)1.4.2 类钙粘蛋白(Cadherin-like protein)1.4.3 其他受体蛋白1.5 受体蛋白的表达及功能研究1.5.1 APN的异源细胞表达1.5.2 类钙粘蛋白的异源细胞表达1.6 杆状病毒载体表达系统1.6.1 昆虫杆状病毒表达系统的优缺点1.6.2 Bac to Bac表达系统的原理1.6.3 昆虫杆状病毒表达系统的发展1.6.3.1 BaculoDirect Express System1.6.3.2 家蚕核型多角体病毒—家蚕表达系统第二章 本研究的内容和意义2.1 研究内容2.1.1 棉铃虫敏感、抗性品系的APN1基因的克隆2.1.2 棉铃虫敏感、抗性品系的APN1在Tn细胞中的表达2.1.3 重组棉铃虫敏感、抗性品系的APN1的纯化2.1.4 棉铃虫敏感、抗性品系APN活力测定2.2 技术路线2.2.1 棉铃虫APN1在Tn细胞中的表达及纯化技术路线2.2.2 棉铃虫敏感、抗性品系APN活力的测定技术路线2.3 研究目的与意义第三章 棉铃虫敏感、抗性品系APN1基因克隆3.1 材料与方法3.1.1 实验材料3.1.1.1 供试昆虫3.1.1.2 引物设计与合成3.1.1.3 酶与试剂3.1.1.4 菌株、质粒和细胞3.1.1.5 培养基3.1.1.6 主要仪器3.1.1.7 常用储存液与缓冲液3.1.2 试验方法3.1.2.1 RNA的提取3.1.2.2 反转录3.1.2.3 APN1的扩增3.1.2.4 PCR产物的回收纯化3.1.2.5 TA克隆3.1.2.6 转化DH5α3.1.2.7 质粒DNA的提取3.1.2.8 检测3.1.2.9 序列测定3.2 试验结果3.2.1 棉铃虫敏感、抗性品系APN1基因克隆3.2.2 APN1基因序列分析3.3 讨论第四章 棉铃虫敏感、抗性品系APN1在TN细胞中表达4.1 材料与方法4.1.1 试验材料4.1.1.1 酶与试剂4.1.1.2 菌株、质粒和细胞4.1.1.3 培养基4.1.1.4 主要仪器4.1.1.5 常用储存液与缓冲液4.1.2 试验方法4.1.2.1 重组转移载体的构建4.1.2.2 重组杆粒的提取与鉴定4.1.2.3 细胞培养4.1.2.4 共转染与感染4.1.2.5 重组蛋白的表达4.2 试验结果4.2.1 重组转移质粒构建与鉴定4.2.2 重组杆状病毒DNA Bacmid的鉴定4.2.3 重组蛋白表达与鉴定及病毒的滴度测定4.2.3.1 细胞形态反应4.2.3.2 滴度测定4.2.3.3 SDS-PAGE结果4.2.3.4 Ligand blot结果4.3 讨论4.3.1 表达系统的选择4.3.2 重组棉铃虫敏感、抗性品系APN1蛋白与毒素的结合能力第五章 重组棉铃虫敏感、抗性品系APN1的纯化5.1 材料与方法5.1.1 试验材料5.1.1.1 试剂和酶5.1.1.2 主要仪器5.1.1.3 常用储存液与缓冲液5.1.2 试验方法5.1.2.1 样品的制备5.1.2.2 Ni离子亲和层析5.1.2.3 透析5.2 试验结果5.3 讨论第六章 棉铃虫敏感、抗性品系APN活力测定6.1 材料与方法6.1.1 试验材料6.1.1.1 供试昆虫6.1.1.2 酶与试剂6.1.1.3 常用储存液与缓冲液6.1.2 试验方法6.1.2.1 BBMV的提取6.1.2.2 蛋白浓度测定6.1.2.3 APN活性的测定6.2 试验结果6.3 讨论第七章 小结7.1 棉铃虫敏感、抗性品系的APN1基因的克隆7.2 棉铃虫敏感、抗性品系的APN1在TN细胞中的表达7.3 重组棉铃虫敏感、抗性品系的APN1的纯化7.4 棉铃虫敏感、抗性品系APN活力测定参考文献致谢附录
相关论文文献
标签:棉铃虫论文; 氨肤酶论文; 毒素受体论文; 表达系统论文; 表达论文; 纯化论文; 氨肽酶活力论文;
棉铃虫中肠APN活力测定及Bt毒素受体APN1的表达纯化
下载Doc文档