三种有机磷农药残留免疫检测方法的建立与应用

论文摘要

本研究以γ-氨基丁酸和农药中间体为原料合成了甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱三种有机磷农药人工半抗原O-甲基-O-（4-硝基苯基）-N-（丁酸）硫代磷酸酯（H1）、O-甲基-O-（3-甲基,4-硝基苯基）-N-（丁酸）硫代磷酸酯（H2）和O-甲基-O-（3,5,6三氯吡啶基）-N-（丁酸）硫代磷酸酯（H3）,利用4-溴代丁酸乙酯和农药中间体为原料合成了另外三种半抗原4-硝基苯基-O-丁酸（H4）,3-甲基4-硝基苯基-O-丁酸（H5）和3,5,6-三氯吡啶基-O-丁酸（H6）;通过活泼酯法将H1、H2和H3分别交联于牛血清白蛋白（BSA）上制备免疫原,将H1、H2、H3、H4、H5和H6分别交联于卵清蛋白（OVA）上制备包被原。以等量混合的H1-BSA、H2-BSA和H3-BSA制成的混合免疫原HA-BSA混合免疫BALB/c小鼠,采用常规杂交瘤技术,用PEG法将其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经ELISA法筛选及有限稀释法亚克隆化,建立可稳定分泌分别抗甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱的杂交瘤细胞株。结果获得了一株可稳定分泌抗甲基对硫磷的杂交瘤细胞株（3H9/A3）,两株可稳定分泌抗杀螟硫磷的杂交瘤细胞株（3H9/B3、6C8/H6）,一株可稳定分泌抗甲基毒死蜱的杂交瘤细胞株（3G7/F5）,所分泌的抗体类型及亚类均为IgG1,轻链均为k链,通过对抗体效价的检测比较,选用3H9/A3、6C8/H6和3G7/F5三株细胞株作进一步研究,三者所分泌的抗体亲和常数分别达1.23×108L/mol、2.0×107L/mol和3.09×108L/mol。细胞株3H9/A3、6C8/H6和3G7/F5所分泌的抗体分别对甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱具有明显的识别作用,为建立三种农药的残留分析奠定了基础。以杂交瘤细胞株3H9/A3、6C8/H6、3G7/F5分泌的单克隆抗体为基础,通过对检测体系中盐封闭物、离子强度、pH值等影响因子的研究建立了甲基对硫磷、杀螟硫磷以及甲基毒死蜱的ELISA检测体系。以Logit(B/Bo作纵坐标与农药浓度的对数值作横坐标建立标准曲线,甲基对硫磷在0.01μg/ml～10μg/ml范围内呈显著线性关系,检测方程为y=-1.02x-0.9894,相关系数R2达0.9744,IC50为0.107μg/ml,在土壤、自来水以及青菜中的添加回收率分别为84.3%、93.9%、100.5%;杀螟硫磷在0.001ng/ml～100ng/ml范围内呈显著线性关系,检测方程为y=-0.4421x-0.5681,相关系数R2达0.9947,IC50为0.052ng/ml,在土壤、自来水以及青菜中的添加回收率分别为84.5%、99.05%、94.9%;甲基毒死蜱在0.01μg/ml～100μg/ml范围内呈显著线性关系,检测方程为y=-0.9476x-1.0641,相关系数R2达0.9951,IC50为0.075μg/ml在土壤、自来水以及青菜中的添加回收率分别为85.1%、104.8%、90.2%。本研究采用混合免疫方法在一次细胞融合过程中获得了三种单克隆抗体,为能在较短的研制周期内获得多种不同农药的单克隆抗体,提高抗体的产出率提供了理论基础;并用所得抗体分别建立了甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱的三种有机磷农药残留ELISA快速检测法,为农药残留检测试剂盒的开发提供了基础,为环境安全检测提供了重要的工具。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 上篇 文献综述
• 第一章 农药残留速测研究的必要性
• 1 农药残留的现状及危害
• 1.1 农药残留的现状
• 1.2 农药残留问题的主要危害
• 1.3 农药残留的主要来源
• 2 国内外对农药残留的关注
• 2.1 发达国家对农药残留的高度关注
• 2.2 FAO/WHO对农药残留高度关注
• 2.3 我国农药残留控制措施的研究进展
• 2.4 开展农药残留速测技术研究的意义
• 3 农药残留分析技术的发展动态
• 3.1 农药残留常规检测方法
• 3.2 新技术在农药残留检测中的应用
• 第二章 免疫检测技术在农药残留分析中的应用
• 1 农药等小分子人工抗原制备
• 1.1 半抗原的设计与合成
• 1.2 载体蛋白的选择
• 1.3 偶联方法的选择
• 1.4 鉴定与结合比估算
• 2 农药等小分子抗体制备技术研究进展
• 2.1 多克隆抗体的制备
• 2.2 单克隆抗体的制备
• 2.3 基因重组抗体的制备
• 2.4 小分子物聚合材料抗体
• 3 农药残留免疫检测技术的进展
• 3.1 农药残留酶免疫分析技术
• 3.2 免疫分析芯片
• 3.3 免疫试纸条
• 下篇 研究内容
• 甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱三种有机磷农药残留免疫检测方法的建立与应用
• 第一节 甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱三种有机磷农药抗原的合成与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 主要试剂及仪器
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 半抗原结构鉴定
• 2.2 人工抗原偶联鉴定
• 2.3 混合抗原的制备
• 3 讨论
• 3.1 关于半抗原的设计
• 3.2 关于抗原的合成与鉴定
• 第二节 混合免疫制备甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱三种有机磷农药的单克隆抗体
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 实验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 小鼠血清效价测定
• 2.2 杂交瘤细胞株的建立
• 2.3 杂交瘤细胞株的冻存及复苏
• 2.4 杂交瘤细胞及单克隆抗体的鉴定
• 2.5 单克隆抗体的大量制备
• 2.6 单克隆抗体的亲和性
• 2.7 单克隆抗体的特异性分析
• 2.8 单克隆抗体的稳定性
• 3 讨论
• 3.1 关于混合免疫
• 3.2 关于单克隆抗体的大量制备
• 第三节 甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱三种有机磷杀虫剂间接竞争ELISA方法的建立
• 1 实验材料与方法
• 1.1 材料与仪器
• 1.2 甲基对硫磷、杀螟硫磷和甲基毒死蜱间接竞争ELISA最佳工作条件的确定
• 1.3 标准曲线的建立及添加回收试验
• 2 结果与分析
• 2.1 抗原抗体最佳工作浓度的确定
• 2.2 最佳包被抗原的选择
• 2.3 最佳封闭物的选择
• 2.4 基质对ELISA检测结果的影响
• 2.5 ELISA标准曲线的建立
• 2.6 标准曲线的质量控制指标
• 3 讨论
• 3.1 关于包被抗原的选择
• 3.2 关于抗体的特性分析
• 3.3 关于间接竞争ELISA最佳工作条件的确定
• 全文总结
• 参考文献
• 附录一
• 附录二
• 致谢