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大菱鲆红体病虹彩病毒主要衣壳蛋白与宿主蛋白的相互作用研究

2020-12-01阅读(532)

大菱鲆红体病虹彩病毒主要衣壳蛋白与宿主蛋白的相互作用研究

论文摘要

大菱鲆红体病虹彩病毒（turbot reddish body iridovirus,TRBIV）是我国养殖大菱鲆病毒性疾病的主要病原之一,TRBIV主要衣壳蛋白（Major Capsid Protein,MCP）是病毒最主要的结构蛋白。本研究运用酵母双杂交系统,筛选与TRBIV MCP相互作用的大菱鲆脾细胞蛋白,从而揭示虹彩病毒感染宿主细胞的分子机制,为鱼类虹彩病毒的致病机理研究打下基础。首先,构建了用于酵母双杂交的诱饵质粒pDEST32-MCP。采用invitrogen公司的pENTR Directional TOPO Cloning kit构建了pENTR-MCP质粒;pENTR-MCP与载体pDEST32应用Gateway重组反应得到pDEST32-MCP质粒,经酶切鉴定确定重组子。利用CloneMiner. cDNA Library Construction Kit构建了大菱鲆（Scophthalmus maxims）脾细胞cDNA文库。从大菱鲆脾细胞中提取总RNA ,再分离纯化出mRNA。逆转录得到第一链cDNA,继而合成了双链平末端cDNA。经纯化定量后,应用GatewayBP技术同源重组,得到pDONR222-cDNA ,从而获得大菱鲆脾细胞cDNA文库。经测定扩增后文库滴度为2.52×107 cfu/ml,插入片段大部分分布在500-1000bp之间,平均大小约为787.6bp,可用作酵母双杂交的筛选文库。将pDEST32-MCP转入酵母菌株MaV203,通过自激活检测确定3AT浓度。pDONR222-cDNA通过Gateway LR重组反应与pDEST22载体连接,得到pDEST22-cDNA并转化入含有pDEST32-MCP的酵母菌株MaV203,分别在选择性平板上筛选阳性克隆,阳性克隆经序列测定p22大小为1117bp,p23大小为891bp, p31大小为491bp,p31与p23部分重合。分析结果表明,p23与60s核糖蛋白L23有很高的同源性,相似度达100%;p22无较大范围内的同源序列,说明是新的基因片段。另有4个表型为强阳性的克隆经鉴定不属于cDNA片段,其来源及序列结构有待进一步研究。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 文献综述
  • 第一节 鱼类抗病毒的非特异性免疫机制研究进展
  • 1. 自然杀伤细胞
  • 2. 单核巨噬细胞系统
  • 3. 干扰素
  • 4. 结语
  • 第二节 酵母双杂交系统的原理及研究进展
  • 1. 酵母双杂交系统的构建原理
  • 2. 酵母双杂交系统的发展
  • 第二章 pDEST32-MCP 诱饵质粒的构建
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 TRBIV MCP 基因的PCR 扩增
  • 1.2 pENTR-MCP 重组质粒的构建与扩增
  • 1.3 pDEST32-MCP 诱饵重组质粒的构建与扩增
  • 2. 结果
  • 2.1 引物设计
  • 2.2 MCP 扩增结果
  • 2.3 PCR 产物的纯化与定量结果
  • 2.4 pENTR-MCP 的酶切鉴定
  • 2.5 pENTR-MCP 的测序结果
  • 2.6 pDEST32-MCP 重组质粒的提取及酶切鉴定
  • 3. 讨论
  • 第三章 大菱鲆（Scophthalmus maxims）脾细胞cDNA 文库的构建
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 实验流程
  • 1.2 主要实验材料与试剂
  • 1.3 大菱鲆脾细胞总RNA 的提取和检测
  • 1.4 大菱鲆脾细胞mRNA 的分离与浓缩
  • 1.5 cDNA 第一链的合成
  • 1.6 dsDNA 的合成与纯化
  • 1.7 在dsDNA 5’端加上att81 接头
  • 1.8 dsDNA 产物的纯化及定量
  • 1.9 dsDNA 与pDONR222 载体的重组及扩增
  • 1.10 文库的鉴定
  • 2. 结果
  • 2.1 大菱鲆脾细胞总RNA 的提取及mRNA 的分离
  • 2.2 dsDNA 的合成
  • 2.3 cDNA 的纯化及定量
  • 2.4 cDNA 文库的构建及鉴定
  • 3. 讨论
  • 第四章 应用酵母双杂交技术筛选大菱鲆脾细胞cDNA 文库
  • 第一节 pDEST32-MCP 与pDEST22-cDNA 文库的酵母双杂交实验
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 含pDEST32-MCP 诱饵质粒的酵母MaV203 的转化和筛选
  • 1.2 诱饵质粒的自激活性检测
  • 1.3 pDEST22-cDNA 文库的准备及酵母双杂交实验
  • 2. 结果
  • 2.1 MaV203 中MCP 的PCR 鉴定
  • 2.2 诱饵蛋白的自激活测试
  • 2.3 pDEST32-MCP 诱饵质粒与pDEST22-cDNA 文库质粒的酵母双杂交实验
  • 3. 讨论
  • 第二节 阳性克隆的筛选鉴定及回复双杂交检测
  • 1. 材料与方法
  • 1.1 阳性克隆的筛选
  • 1.2 阳性克隆的鉴定
  • 1.3 cDNA 插入片段的测序
  • 1.4 cDNA 插入片段的生物信息学分析
  • 1.5 回复双杂交检测
  • 2. 结果与分析
  • 2.1 阳性克隆的表型确认
  • 2.2 以酵母质粒为模板的 PCR 鉴定
  • 2.3 以大肠杆菌质粒为模板的 PCR 鉴定
  • 2.4 cDNA 插入片段的测序结果
  • 2.5 DNA 序列分析
  • 2.6 蛋白序列分析
  • 2.7 回复双杂交检测结果
  • 2.8 2，3，4，25 号菌株质粒的鉴定
  • 2.9 2，3，4，25 号自激活检测
  • 3. 讨论
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

    • 相关论文文献

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