论文摘要
随着全球转基因产品的日益增多,以及越来越多的转基因作物特异品系获得商品化生产,检测特异性品系已成为国际上转基因成分检测的发展趋势。普通PCR法和实时荧光PCR法是目前检测转基因特异品系的主要方法,但各有缺点,因此急需建立能够普遍适用于检验检疫一线的基层实验室的快速、简便、高效、准确的转基因品系检测方法。环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）是一种新颖的在恒温条件下进行核酸扩增的方法,具有简便、高效、特异、快速等优点,灵敏度、特异性能媲美甚至优于普通PCR法,不依赖任何专门的仪器设备就能实现现场高通量快速检测,检测成本远低于实时荧光PCR法。LAMP技术在食源性致病微生物的快速检测中已得到广泛应用,但在转基因产品,尤其是转基因特异品系检测上的应用研究甚少。本文针对转基因大豆A2704-12品系、转基因玉米GA21品系的特异序列,分别设计了7套、3套LAMP引物,各筛选出1套特异性好的LAMP引物,对反应条件、反应体系进行了优化,建立了转基因大豆A2704-12品系、转基因玉米GA21品系的LAMP检测方法,并进行了实际应用,为转基因产品特异品系的快速检测构建了良好的技术平台。根据转基因大豆A2704-12品系外源基因和大豆边界序列设计了7套LAMP引物,通过反应温度优化、特异性测定,筛选出1套特异性好的LAMP引物,包括内引物、外引物和环引物各1对。在LAMP反应体系中加入SYBR Green I荧光染料,在实时荧光定量PCR仪上进行实时监控,对筛选出的这套LAMP引物进行了反应条件、反应体系的优化。优化后的反应条件为：63℃ 1 h,80℃ 5 min。优化后的反应体系为：lOxThermo Pol缓冲液2.5μL,外引物F3 （10μmol/L）0.5 μL,外引物B3 （10 μmol/L） 0.5μL,环引物LF （40μmol/L） 0.5 μL,环引物LB （40 μmol/L） 0.5μL,内引物FIP （40μmol/L） 1.0 μL,内引物BIP （40 μmol/L） 1.0 μL, dNTPs（10 mmol/L）4.0 μL,甜菜碱（5 mol/L）6.0μL, MgSO4（150mmol/L） 1.0 μL, Bst DNA聚合酶（8U/μL） 1.0 μL, DNA模板（50ng/μL）2.0μL, ddH2O4.5μL。以不同转基因大豆品系、不同植物的DNA为模板,按照优化后的反应条件和反应体系进行LAMP检测,没有出现假阳性结果,表明建立的LAMP检测方法的特异性很好。LAMP法的灵敏度测定结果表明LAMP法的最低限可达到0.1%,虽稍低于实时荧光PCR法的0.05%,但已达到目前多数国家或地区对转基因产品进行标识的法定限量要求,能满足日常检测需求。以5% A2704-12、非转基因大豆的DNA为模板,分别进行20次LAMP重复检测,结果显示20次重复的LAMP检测结果完全一致,表明建立的LAMP检测方法的稳定性很好。将建立的LAMP检测方法应用于大豆及其制品中A2704-12品系的检测,以实时荧光PCR检测结果为对照,LAMP方法的检测准确率达到100%。根据转基因玉米GA21品系外源基因的序列设计了3套LAMP引物,通过反应温度优化、特异性测定,筛选出1套特异性强的LAMP引物,包括内引物、外引物和环引物各1对。对筛选出的1套LAMP引物进行了反应条件、反应体系的优化。优化后的反应条件为：63℃ 1 h,80℃ 5 min。优化后的反应体系为：10 ×Thermo Pol缓冲液2.5μL,外引物F3 （10 μmol/L） 0.5 μL,外引物B3 （10 μmol/L） 0.5μL,环引物LF （40 μmol/L） 0.5μL,环引物LB （40 μmol/L） 0.5μL,内引物FIP（40 μmol/L）1.0μL,内引物BIP（40 μmol/L） 1.0μL, dNTPs（10 mmol/L） 3.5 μL,甜菜碱（5 mol/L） 4.0 μL,硫酸镁（150 mmol/L） 1.0 μL,Bst DNA聚合酶（8U/μL） 1.0 μL,DNA模板（100ng/μL） 2.0 μL, ddH2O 7.0μL。以不同转基因玉米品系、不同植物的DNA为模板,按照优化后的反应温度和反应体系进行LAMP检测,没有出现假阳性结果,表明特异性很好。LAMP法和实时荧光PCR法的灵敏度一致,最低限均可达到0.05%,能满足日常检测需求。用5%GA21、非转基因玉米的DNA分别进行20次LAMP重复检测,结果表明建立的LAMP检测方法的稳定性很好。将建立的LAMP检测方法应用于玉米及其制品中GA21品系的检测,以实时荧光PCR检测结果为对照,LAMP方法的检测准确率达到100%。