胸膜肺炎放线杆菌血清10型弱毒株的构建和环介导的APP apxIV恒温扩增方法的建立

论文摘要

由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,MHP）和胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）单独感染或混合感染是引起目前呼吸道综合症的主要原因之一,给养猪业造成严重的危害。猪传染性胸膜肺炎弱毒疫苗是一种新型疫苗,优于传统的灭活疫苗,它可以激发良好的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫,具有良好的抗体反应和不同血清型菌感染的交叉保护,而且使用方便、成本低,是当前国内外研究的热点。针对临床中这两种病原同时感染或继发感染的现状,而分别接种单独的疫苗会造成猪只的应激和养殖成本增加,以致弱的胸膜肺炎放线杆菌表达MHP主要抗原蛋白的突变株,并研制有效的基因工程疫苗,是预防这两种呼吸道传染病的策略。本研究以APP血清10型菌株和猪肺炎支原体为材料,分别克隆APP毒素apxⅠ操纵子的调节基因apx IC以及MHP主要免疫原性蛋白——乳酸脱氢酶（P36）基因,将P36基因插入到apx IC,构建含抗生素标记和负向筛选标记的中间转移载体pEICALDH。将pEICALDH热激法转化大肠杆菌X7213感受态细胞,将转化的阳性子再与胸膜肺炎10型菌进行接合转移试验,通过同源重组,在DAP缺乏的含NAD的TSA培养基上,利用营养缺陷筛选法和SacB负向筛选法,获得P36基因插入apxIC基因的APP突变株,该突变株不含抗生素抗性基因,用突变株培养上清,浓缩后进行western bolt检测,发现浓缩蛋白能与毒素Ⅰ单抗反应。将该毒株划线接种于含绵羊红细胞和NAD的TSA培养基上,观察24-72个小时,未发现溶血现象,说明该突变株丧失了亲本菌株所具有的溶血活性。将107CFU/ml的突变株和亲本菌分别接种10只Balb/C小鼠,连续观察14天,亲本菌在接种后24小时内小鼠全部死亡,而突变株接种组小鼠死亡3只,TSB接种组小鼠全部存活,说明突变株对小鼠的毒力下降;用2×106CFU/ml重组菌免疫Balb/C小鼠,一个月后用2×108CFU/ml亲本菌攻击免疫鼠,保护率为100%,而TSB对照组小鼠全部死亡。这些结果说明,该突变株有望用于疫苗研究。环介导的基因扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）是一种新型的恒温核酸扩增方法,具有特异、高效、快速的特征。利用水浴锅以及基于apxⅣ基因设计的6个特异性引物,LAMP可以在30分钟内快速检测胸膜肺炎放线杆菌。通过加入SYBR GreenⅠ染料,扩增产物可以肉眼观察。LAMP法检测胸膜肺炎放线杆菌的特异性与Nested PCR相当,但敏感性高于Nested PCR,此方法可以成为快速检测胸膜肺炎放线杆菌的重要手段。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1 猪传染性胸膜肺炎的危害
• 2 猪传染性胸膜肺炎疫苗
• 2.1 灭活疫苗
• 2.2 亚单位疫苗
• 2.3 弱毒活疫苗
• 2.4 ghosts疫苗
• 2.5 口服疫苗
• 3 猪支原体肺炎
• 3.1 猪肺炎支原体免疫相关蛋白
• 3.1.1 P46
• 3.1.2 P65
• 3.1.3 P74
• 3.1.4 细胞溶质蛋白P36
• 3.2 猪肺炎支原体的粘附因子
• 3.2.1 P97
• 3.2.2 P110
• 3.2.3 其它粘附因子
• 3.3 热休克蛋白
• 3.3.1 Hsp60
• 3.3.2 Hsp42
• 3.4 猪支原体肺炎疫苗研究现状
• 3.4.1 常规疫苗
• 3.4.2 基因工程疫苗
• 3.4.2.1 核苷酸还原酶（NrdF）的R2亚基重组疫苗
• 3.4.2.2 表达文库免疫（Expression library immunization,ELI）
• 3.4.2.3 粘附因子相关疫苗的研究
• 3.4.2.4 DNA疫苗
• 3.4.2.5 肽疫苗
• 4.猪传染性胸膜肺炎和支原体肺炎的混合感染和防制
• 5.环介导的核酸恒温扩增（LAMP）
• 5.1 LAMP的原理
• 5.1.1 循环扩增反应启始物的形成
• 5.1.2 循环扩增反应
• 5.2 LAMP的操作步骤
• 5.2.1 反应体系
• 5.2.2 操作程序
• 5.3 LAMP技术的优点
• 5.3.1 灵敏度高
• 5.3.2 特异性强
• 5.3.3 所需时间短
• 5.3.4 设备简单
• 5.3.5 产物检测便捷
• 5.4 LAMP的应用
• 5.4.1 病毒病原体的检测
• 5.4.2 细菌病原体的检测
• 5.4.3 寄生虫病的检测
• 第2章 胸膜肺炎放线杆菌血清10型弱毒株的构建
• 1.研究目的和意义
• 2.材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 细菌菌株
• 2.1.2 载体与质粒
• 2.1.3 主要药品及试剂
• 2.1.4 主要培养基和抗生素
• 2.1.5 引物
• 2.1.6 缓冲液
• 2.1.6.1 质粒提取用缓冲液
• 2.1.6.2 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）缓冲液
• 2.1.6.3 Western blot缓冲液
• 2.1.7 细菌基因组DNA提取试剂
• 2.1.8 大肠杆菌感受态制备用试剂
• 2.1.9 其它缓冲液及试剂
• 2.1.10 实验动物
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 猪肺炎支原体主要免疫原性基因P36基因的扩增
• 2.2.2 细菌活化
• 2.2.3 细菌（APP）基因组DNA提取
• 2.2.4 PCR或酶切产物的回收与纯化
• 2.2.5 大肠杆菌感受态细胞的制备（氯化钙法）
• 2.2.6 连接产物及质粒的转化
• 2.2.7 重组质粒PCR鉴定
• 2.2.8 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.9 质粒的小量制备（改良的碱裂解法）
• 2.2.10 质粒的大量制备（碱裂解法）
• 2.2.11 胸膜肺炎放线杆菌电转化感受态细胞的制备
• 2.2.12 胸膜肺炎放线杆菌电转化
• 2.2.13 接合转移
• 2.2.14 突变株的鉴定
• 2.2.15 溶血性试验
• 2.2.16 毒素Apx Ⅰ的提取
• 2.2.17 Western blot
• 2.2.18 间接荧光抗体试验（IFA）
• 2.2.19 小鼠毒力测定
• 2.2.20 保护力测定
• 3.结果与分析
• 3.1 胸膜肺炎放线杆菌apxICA基因的PCR扩增
• 3.2 肺炎支原体P36基因的PCR扩增
• 3.3 重组质粒pEICALDH的构建
• 3.4 基因工程突变株的电转化法筛选
• 3.5 基因工程突变株的接合转移法筛选
• 3.6 基因工程突变株PCR鉴定
• 3.7 基因工程突变株生物学特性
• 3.7.1 突变菌株丧失溶血活性
• 3.7.2 P36基因与毒素IA的表达
• 3.7.3 突变株对小鼠的毒力下降
• 3.7.4 免疫鼠获得抵抗胸膜肺炎亲本菌株攻击的能力
• 4.讨论
• 4.1 细菌载体的选择
• 4.2 APP10型菌作为亲本株的优点
• 4.3 肺炎支原体基因的表达
• 4.4 突变株构建的策略
• 4.4.1 直接电转化
• 4.4.2 SacB筛选
• 4.4.3 细菌接合转移
• 4.5 展望
• 第3章 环介导的App apxⅣ恒温扩增法的建立
• 1.研究目的和意义
• 2.材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 细菌菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 引物设计
• 2.2.2 细菌培养
• 2.2.3 模板的制备
• 2.2.4 LAMP扩增
• 2.2.5 Nested PCR
• 2.2.6 特异性检测
• 2.2.7 敏感性检测
• 3.结果与分析
• 3.1 LAMP扩增
• 3.2 Nested PCR扩增
• 3.3 LAMP产物视觉直接观察
• 3.4 特异性检测
• 3.5 敏感性检测
• 4.讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢