小鼠和猪胚胎玻璃化冷冻保存及其相关技术的研究

论文摘要

本试验以小鼠和猪的囊胚为试验材料,对其玻璃化冷冻保存体系进行了研究。试验内容包括:1)小鼠囊胚和扩张囊胚的玻璃化冷冻保存的研究;2)小鼠囊胚和扩张囊胚冷冻后线粒体聚集的研究;3)猪超数排卵的研究;4)猪囊胚和扩张囊胚的玻璃化冷冻保存的研究。本试验通过小鼠胚胎的玻璃化冷冻保存及冷冻后线粒体聚集的研究,旨在为猪胚胎的冷冻保存进行初步的探索,也为猪胚胎玻璃化冷冻保存的研究积累经验并提供借鉴。研究结果如下: 1 小鼠囊胚和扩张囊胚的玻璃化冷冻保存的研究 本试验以6M甘油+6.5%PVP（V1）和8MEG+7%PVP（V2）为玻璃化溶液,采用细管法和OPS一步法对小鼠囊胚进行冷冻。结果表明:胚胎在玻璃化液中平衡20S存活率显著高于平衡60S后的存活率（P<0.05）。V1和V2玻璃化冷冻溶液对囊胚冷冻后的发育率没有显著的影响（P>0.05）。在细管一步法冷冻保存的囊胚,用不同解冻程序对胚胎解冻后发育率进行研究,结果表明:蔗糖四步法解冻后的发育率与蔗糖三步法冷冻解冻后的发育率差异不显著（P>0.05）,但两种方法均显著高于蔗糖两步法解冻后的发育率（P<0.05）、 冷冻方法冷冻对解冻后胚胎的体外发育率有一定的影响。本研究表明:用OPS三步法冷冻后（V2）的小鼠囊胚的体外发育率显著高于细管法和OPS一步法冷冻后的发育率（P<0.01）。 在OPS三步法冷冻过程中,平衡时间对胚胎冷冻后的发育率有一定的影响。采用V1溶液进行OPS三步法冷冻时,胚胎在25%的V1溶液中平衡10-15分钟后的发育率显著高于平衡20分钟后的发育率（P<0.05）;胚胎在2M的V2溶液中平衡3-4分钟后的发育率显著高于平衡5分钟后的发育率（P<0.05）。 此外,试验还比较了冷冻阶段对胚胎冷冻后发育率的影响。结果表明,发育阶段对的胚胎的体外发育率无显著的影响（P>0.05）。 2 小鼠胚胎线粒体聚集的研究 用罗丹明123荧光分子探针对玻璃化冷冻后小鼠胚胎线粒体的损伤进行了研究。将V1冷冻的囊胚和V2冷冻的扩张囊胚解冻后,将胚胎在体外进行培养,分别在0h、4h、8h、12h、18h和24h观察线粒体的损伤情况,结果表明无论是用V1溶液还是用V2溶液对胚胎进行玻璃化冷冻,随着培养时间的延长,线粒体的正常聚集率均呈现

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 文献综述
• 猪胚胎冷冻保存的研究进展
• 1 猪胚胎冷冻保存的研究现状
• 1.1 慢速冷冻保存
• 1.2 玻璃化冷冻方法
• 2 猪胚胎冷冻保存的影响因素
• 2.1 温度因素
• 2.2 胚胎的发育阶段
• 2.3 胚胎细胞质内的脂肪滴的影响
• 3 胚胎冷冻保存过程中的冷冻损伤
• 3.1 细胞骨架的损伤
• 3.2 细胞膜的损伤
• 4 胚胎冷冻保存的前景
• 参考文献
• 试验研究
• 试验一 小鼠囊胚和扩张囊胚玻璃化冷冻保存的研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 操作液
• 1.3 试验方法
• 1.4 数据统计分析
• 2 结果
• 2.1 小鼠囊胚和扩张囊胚培养24H后的发育率
• 2.2 冷冻液和平衡时间对细管一步法冷冻囊胚发育率的影响
• 2.3 冷冻液和平衡时间对OPS一步法冷冻囊胚发育率的影响
• 2.4 解冻方法对细管一步法冷冻（V1）囊胚发育率的影响
• 2.5 平衡时间对OPS三步法冷冻囊胚（V1）发育率的影响
• 2.6 平衡时间对OPS三步法冻冻囊胚（V2）)发育率的影响
• 2.7 不同发育阶段胚胎经OPS三步法冷后发育率的比较
• 2.8 冷冻方法对小鼠囊胚冷冻解冻后（V2）发育率的影响
• 3 讨论
• 3.1 不同平衡时间对小鼠囊胚体外发育率的影响
• 3.2 不同的解冻程序对V1冷冻的囊胚解冻的影响
• 3.3 OPS三步法及平衡时间对胚胎冷冻效果的影响
• 3.4 不同冷冻方法对胚胎冷冻结果的影响
• 3.5 不同发育阶段的胚胎对玻璃化冷冻胚胎发育率的影响
• 参考文献
• 试验二 小鼠胚胎冷冻后线粒体分布的研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 1.3 线粒体在不同发育阶段胚胎内的正常分布特征
• 1.4 线粒体在不同发育阶段胚胎内的异常分布特征
• 1.5 数据统计分析
• 2 结果
• 2.1 对照组囊胚和扩张囊胚的线粒体正常聚集率
• 2.2 用V1冷冻保存的囊胚在解冻后不同培养时间对其线粒体分布的影响
• 2.3 用V2冷冻保存的扩张囊胚在解冻后不同培养时间对其线粒体分布的影响
• 3 分析
• 参考文献
• 试验三 猪超数排卵影响因素的研究
• 引言
• 1 试验材料与方法
• 1.1 试验动物
• 1.2 超排药品和器械
• 1.3 供体母猪的选择
• 1.4 超排和胚胎收集
• 1.5 数据统计分析
• 2 结果
• 2.1 经产母猪供体品种对超排效果的影响
• 2.2 不同激素水平对后备猪超排效果的影响
• 2.3 重复超排对母猪超排效果的影响
• 3 讨论
• 3.1 不同品种对超排效果的影响
• 3.2 PMSG激素剂量对后备母猪超排效果的影响
• 3.3 重复超排对母猪超排效果的影响
• 参考文献
• 试验四 猪胚胎的玻璃化冷冻保存研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验动物
• 1.2 试验药品
• 1.3 母猪的超数排卵
• 2 胚胎的冷冻保存
• 2.1 猪胚胎的常规冷冻保存
• 2.2 猪胚胎的玻璃化冷冻保存
• 2.3 数据统计分析
• 3 结果
• 3.1 囊胚和扩张囊胚经常规冷冻后体外发育率的比较
• 3.2 不同玻璃化冷冻液对猪扩张囊胚的冷冻效果的比较
• 3.3 不同冷冻处理方法对V1玻璃化冷冻猪早期胚胎效果的影响
• 3.4 不同冷冻方法对V2玻璃化冷冻早期胚胎冷冻效果的影响
• 3.5 基础液对V1玻璃化冷冻猪胚胎体外存活率的影响
• 3.6 猪胚胎的移植结果
• 3.7 线粒体分布的检测结果
• 3.8 数据统计分析
• 4 分析讨论
• 4.1 囊胚和扩张囊胚经常规冷冻后体外发育率的比较
• 4.2 不同的冷冻处理对囊胚冷冻效果的影响
• 4.3 不同基础液对V1玻璃化冷冻保存猪胚胎体外存活率的影响
• 4.4 胚胎移植结果的分析
• 参考文献
• 总体结论
• 附件
• 致谢