两种双生病毒卫星DNA的遗传结构和种群变异

论文摘要

双生病毒具有独特的孪生颗粒形态,是一类单链环状植物DNA病毒,近年来已在全球多种作物上引起巨大经济损失。已发现部分单组份双生病毒伴随有卫星分子,称为DNAβ,且大多数DNAβ是其辅助病毒诱导寄主产生典型症状所必需的致病决定因子,并与辅助病毒构成双生病毒DNAβ病害复合体,进一步加重危害。研究表明植物RNA病毒具有较高的种群变异水平和丰富的遗传多样性,其种群结构表现“准种”特性,部分双生病毒也被证实具有较高种群变异水平。由于卫星DNAp与双生病毒在遗传上具有共进化关系,为明确DNAp分子在寄主体内的遗传结构特点及种群变异水平,分别将烟草曲茎病毒（Tobacco curly shoot virus, TbCSV）Y35分离物（Y35）与其卫星DNAβ（Y35β）以及中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV）Y10分离物（Y10）与其DNAβ（Y10β）的侵染性克隆经根癌农杆菌介导接种心叶烟和本氏烟,从DNAp的分子克隆出发,对寄主体内DNAp的种群结构和变异水平进行了初步研究。从接种心叶烟和本氏烟植株中共获得3个Y35p种群和8个Y10p种群。对其种群遗传构的分析表明,Y35β和Y10β的种群均具有丰富的遗传多样性,它们均由一群高度相似但不完全一致的序列变异体组成。其中Y35β种群突变克隆百分率为56.3%-90%,突变频率为6.00×10-4～1.27×10-3；而Y10β种群几乎所有克隆均发生突变,其突变克隆百分率和种群突变频率分别达99.2%和2.37×10-33.20×10-3,这说明Y35β变异水平略低于Y10β。除Y35p在接种d利120d的心叶烟中所得种群的突变频率相差一个数量级外,同种卫星DNAβ在不同寄主中以及同一寄主中不同时间所得种群的变异水平无明显差别。对卫星DNAp种群内突变分布的分析表明,碱基突变在DNAp的整个基因组内均有分布。在DNAβ分子的卫星共同区（satellite common region, SCR）、富含A（A-rich）区及βCl基因这三个区段中,Y35p和HY10p均在A-rich区内发生的碱基突变数目最多,其中,Y10β在A-rich区的突变又特别集中在888～901核苷酸位点这一区段。βCl区发生碱基突变的数目明显少于A-rich区。无论Y35β还是Y10p种群,在SCR区内发生的突变均最少,表明该区段最为保守。DNAp种群的碱基突变类型包括碱基替换、缺失和插入。在碱基替换突变类型中,碱基转换的比例明显大于碱基颠换。不同接种时间从同一寄主中所得种群的优势碱基突变类型有所不同,表明虽然在同一寄主体内DNAβ种群变异水平能维持较为稳定的水平,但其碱基突变类型却会出现不同程度的差异。且不同卫星的碱基突变类型也不相同,其中Y35p种群中出现较多的突变类型有G→A突变、T→C突变和c→T突变等,碱基的缺失或插入突变较少；Y10β种群中发生较多的突变类型包括A→G突变、T→C突变以及碱基A缺失和碱基G缺失。Y10β种群内碱基缺失和插入突变的数目明显多于Y35β种群,且碱基A和G的缺失和插入主要发生在A-rich区的888～901核苷酸位点。此外在DNAp种群中还发现多个克隆在同一位点发生相同碱基突变类型的现象。βCl为DNAp分子唯一编码的功能基因。对两种卫星DNAβ在βCl区发生的碱基突变及由此引起的氨基酸突变分析结果表明,βCl区内发生的碱基突变均是非同义突变多于同义突变,且所有同义突变均发生在密码子第三位。Y10β种群在βCl区发生的碱基突变较平均地分布在密码子的三个碱基位置中,而Y35β种群在βCl区的所有突变中,绝大多数发生在密码子第三位。由上述研究结果可以明显看出,两种卫星DNAβ种群均具有较高的变异水平,基本符合病毒和卫星的“准种”结构特征；同时,卫星DNAβ种群具有高于辅助病毒的突变水平,其高突变频率与DNAp分子内A-rich区的高度变异密切相关。由此推测卫星DNAp种群的快速变异可能进一步提高双生病毒病害复合体的寄主适应性从而加速蔓延危害。因此研究DNAp在不同寄主中的遗传结构及变异水平对于解读双生病毒卫星分子的遗传进化轨迹以及掌握其发生流行规律等具有重要意义。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 双生病毒简介
• 2 烟草曲茎病毒（TbCSV）/DNAβ病害复合体研究进展
• 2.1 TbCSV病害复合体各组分的鉴定
• 2.2 TbCSV与小分子DNA及其他双生病毒的互作
• 2.3 TbCSV病害复合体的进化与起源
• 3 中国番茄黄化曲叶病毒（TYLCCNV）/DNAβ病害复合体研究进展
• 3.1 TYLCCNV的发生危害及分离鉴定
• 3.2 TYLCCNV伴随卫星DNAβ
• 3.3 TYLCCNV与伴随卫星DNAβ的互作
• 4 双生病毒及其伴随卫星遗传变异及进化
• 4.1 病毒的种群遗传结构
• 4.2 双生病毒遗传变异及进化
• 引言
• 第二章 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 供试寄主植物
• 1.2 病毒及卫星侵染性克隆
• 1.3 菌株、酶和克隆载体
• 1.4 常用试剂和仪器
• 2 试验方法
• 2.1 农杆菌介导的植株接种
• 2.2 症状观察及样品采集
• 2.3 植物总DNA提取
• 2.4 PCR技术
• 2.5 PCR产物纯化
• 2.6 DNAβ的分子克隆
• 2.7 重组质粒的提取与鉴定
• 2.8 序列测定与突变分析
• 第三章 两种卫星DNAβ的种群遗传结构及变异
• 1 两种卫星DNAβ的种群变异水平
• 2 TbCSV DNAβ的种群结构和变异特点
• 2.1 TbCSV DNAβ在心叶烟中的种群变异
• 2.2 TbCSV DNAβ在本氏烟中的种群变异
• 3 TYLCCNV DNAβ的种群结构和变异特点
• 3.1 TYLCCNV DNAβ在心叶烟中的种群变异
• 3.2 TYLCCNV DNAβ在本氏烟中的种群变异
• 4 讨论
• 第四章 两种卫星DNAβ种群内的突变分布
• 1 TbCSV DNAβ种群内的突变分布
• 1.1 心叶烟中TbCSV DNAβ种群内的突变分布
• 1.2 本氏烟中TbCSV DNAβ种群内的突变分布
• 2 TYLCCNV DNAβ种群内的突变分布
• 2.1 在心叶烟中TYLCCNV DNAβ种群内的突变分布
• 2.2 在本氏烟中TYLCCNV DNAβ种群内的突变分布
• 3 讨论
• 第五章 两种卫星DNAβ种群的碱基突变类型分析
• 1 TbCSV DNAβ种群的碱基突变类型
• 1.1 心叶烟中TbCSV DNAβ种群的碱基突变类型
• 1.2 本氏烟中TbCSV DNAβ种群的碱基突变类型
• 2 TYLCCNV DNAβ种群的碱基突变类型
• 2.1 心叶烟中TYLCCNV DNAβ种群的碱基突变类型
• 2.2 本氏烟中TYLCCNV DNAβ种群的碱基突变类型
• 3 讨论
• 第六章 两种卫星DNAβ种群βc1蛋白的氨基酸变异
• 1 TbCSV DNAββc1蛋白的氨基酸变异
• 2 TYLCCNV DNAββc1蛋白的氨基酸变异
• 3 讨论
• 结论与讨论
• 1 结论
• 2 讨论
• 参考文献
• 附录A 本论文所用病毒缩写及中英文对照
• 附录B 本论文所用缩写词及中英文对照
• 附录C 常用生化及分子生物学试剂与仪器
• 附录D 常用试剂的配制
• 致谢
• 在学期间发表和已录用论文及参加课题