论文摘要
急性早幼粒细胞白血病（Acute promyelocytic leukemia,APL）是血液系统最常见的恶性肿瘤之一,病因尚不完全清楚,主要病变为骨髓中的早幼粒细胞失去进一步分化成熟的能力而停滞在早幼粒阶段。三氧化二砷（Arsenic trioxide,As2O3）用于临床治疗APL已有许多成功的范例,并已成为临床治疗APL的有效措施。研究表明,砷剂作用的重要机制就是它能有效地诱导APL细胞凋亡。目前的研究发现多种细胞核基因组表达基因的改变参与了As2O3诱导的APL细胞凋亡过程。利用基因芯片技术对As2O3诱导APL细胞凋亡过程中凋亡相关基因表达的报告鲜见。有资料显示一些作用于线粒体外膜的基因表达参与了As2O3诱导的肿瘤细胞凋亡的调控,且线粒体在细胞凋亡过程中起着至关重要的作用。但线粒体基因组在该过程中是否表达,线粒体基因组在细胞凋亡中的作用及地位目前未见相关文献报道。因此探讨As2O3诱导NB4细胞凋亡过程中线粒体基因组的表达对于进一步阐明As2O3的作用机制具有重要的意义。本课题采用荧光显微镜、透射电镜、流式细胞仪、DNA Ladder、细胞生长抑制实验、线粒体膜电位检测、RT-PCR等方法,研究As2O3对NB4细胞的诱导凋亡、生长抑制作用;设计线粒体基因组引物,在基因及蛋白质水平对线粒体基因组在该过程中的差异表达进行研究;利用基因芯片技术对1384个凋亡相关基因在As2O3诱导APL细胞凋亡过程中的表达进行研究,为进一步探讨As2O3诱导APL细胞凋亡的分子机制提供有力线索,为As2O3在APL及恶性肿瘤中的应用提供依据。主要的研究结果如下:1.NB4细胞经As2O3诱导凋亡后呈现凋亡的形态学改变。荧光显微镜显示NB4细胞经As2O3处理48h后出现细胞核致密浓染、染色质固缩及片断化断裂,甚至呈碎片状。透视电镜显示细胞核皱缩,形态不规则,染色质边集。对照细胞未见形态学改变。2.As2O3对NB4细胞具有明显的生长抑制作用。As2O3作用于NB4细胞后,在一定的浓度范围内（0.5umol/L-8umol/L）,在同一时间点,随着As2O3浓度的升高,其对NB4细胞的生长抑制率逐渐升高,生长抑制曲线呈“S”型改变,具有明显的量-效效应;而同一浓度的As2O3,其对NB4细胞的生长抑制率随着作用时间的延长而升高,具有明显的时-效效应。给予8umol/L As2O3处理NB4细胞后其生长抑制率于24h、48h、72h分别达到78.8%、91.2%和100%。3.流式细胞仪分析发现NB4细胞经0.5umol/L、1umol/L、2umol/L、3umol/L As2O3其细胞凋亡率分别为5.02%、6.40%、28.40%、33.34%。As2O3浓度越高,NB4细胞凋亡率越高,二者之间具有一定的量效关系。4.以0.5umol/L、1umol/L、2umol/L、4umol/L、8umol/L As2O3分别处理NB4细胞48h后,流式细胞仪检测NB4细胞线粒体膜电位分别下降12.8%、21.6%、66.9%、83.7%、83.8%。5.RT-PCR对As2O3诱导NB4细胞凋亡过程中的13个线粒体基因组基因进行筛选发现COX2在As2O3诱导NB4细胞凋亡过程表达下调,其余12个基因表达无明显改变,Western Blot分析显示COX2在蛋白质水平表达呈降调节。6.通过对1384个凋亡相关基因的mRNA制备的寡核苷酸芯片的研究发现,NB4经2umol/L As2O3诱导凋亡后有16个基因出现差异表达,其中MT2A、SST、NFAT5、SERPINB5等4个基因表达上调,EIF4G2、FDXR、CCT5、TFDP1、PRG1、P2RY6、MPO、ANP32A、CEPBA、HLA-B、YWHAE、TXNDC5等12个基因表达下调,选取其中改变最显著的4个基因进行RT-PCR验证,结果与基因芯片结果一致。结论:1、As2O3在体外具有显著的诱导急性早幼粒白血病细胞（NB4细胞）凋亡及生长抑制效应,这种效应在一定浓度范围内呈现出量效及时效关系。2、As2O3诱导NB4细胞的凋亡作用与线粒体的膜电位下降密切相关,随着细胞凋亡率的提高,线粒体膜电位呈现下降趋势。3、线粒体相关基因COX2的表达变化可能参与了As2O3诱导的NB4细胞凋亡过程。4、在As2O3诱导的NB4细胞凋亡过程中,MT2A、SST、NFAT5、SERPINB5等4个基因表达的升调节及EIF4G2、FDXR、CCT5、TFDP1、PRG1、P2RY6、MPO、ANP32A、CEPBA、HLAB、YWHAE、TXNDC5等12个基因表达的降调节可能参与了这一过程,上述基因表达的变化与As2O3诱导的NB4细胞凋亡密切相关。