论文摘要
胎盘是妊娠期特有的一个器官,主要由滋养细胞构成,具有物质转运、免疫调节和生物合成作用,其功能依赖于结构的完整性。在妊娠过程中,滋养细胞增殖和凋亡,共同调节胎盘的发育、成熟和老化,以满足妊娠的需要。在妊娠早期,胚胎植入是经过滋养细胞侵入子宫壁,受滋养细胞生长情况及功能的影响。滋养细胞增殖与凋亡平衡失调影响滋养细胞浸润过程。胎盘滋养细胞的凋亡可调节滋养细胞增殖,在胎盘组织结构和功能完整性上发挥重要的作用。而滋养细胞的凋亡受到多种因子的调控,TNF-α是其中一种重要的调控滋养细胞生长及功能的细胞因子。目的:本实验模拟自然流产患者体内环境,探讨TNF-α对体外分离纯化培养的正常妊娠早期滋养细胞增殖活性、凋亡及绒毛膜促性腺激素（HCG）分泌的调节功能的影响。方法:1.分离新鲜绒毛组织成功进行人妊娠早期滋养细胞体外原代培养。2.选取生长良好的滋养细胞,经不同浓度TNF-α（0 ng/ml,0.1 ng/ml,1 ng/ml,10 ng/ml,100 ng/ml）作用24h后,利用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法测定细胞的增殖活性A570nm值。3.采用流式细胞仪检测上述经不同浓度TNF-α作用24h后滋养细胞的细胞周期分布、早期凋亡细胞率及晚期凋亡指数。4.采用化学发光免疫法测定上述经不同浓度TNF-α作用24h后的滋养细胞培养液中人绒毛膜促性腺激素（HCG）的含量。结果:1.根据细胞形态学及功能学特点,鉴定细胞为滋养细胞,细胞纯度达95%。倒置显微镜下观察滋养细胞生长情况:3h后开始贴壁变形,18h后基本全部贴壁,呈铺路石样。24h后开始有聚集、融合现象,出现多核细胞。呈类上皮细胞生长,3d传代。2.TNF-α在低浓度（0.1ng/ml）时滋养细胞增殖活性升高（P<0.05）,在高浓度（1,10,100ng/ml）时,滋养细胞的增殖活性降低（P<0.05）,不同浓度TNF-α与滋养细胞的增殖活性之间具有明显的量效关系。3.与对照组比较,滋养细胞经TNF-α作用24h后,其G2期的比例增加（P<0.05）,G1期的比例降低;且在10、100ng/ml浓度TNF-α作用下出现细胞凋亡,早期凋亡率及晚期凋亡指数均随TNF-α浓度增加而增加（P<0.05）,呈明显的量效关系。4.相同浓度TNF-α（10、100ng/ml）作用下,滋养细胞早期凋亡率与晚期凋亡指数比较,前者高于后者（P<0.05）。5.在0100ng/ml范围内TNF-α作用滋养细胞,其分泌HCG水平随TNF-α浓度的增加而升高,呈明显的量效关系（P<0.05）。结论:1.分离纯化新鲜绒毛组织,成功在体外培养人妊娠早期滋养细胞,加入适量浓度的TNF-α,模拟反复流产患者体内滋养细胞周围环境。2.TNF-α影响滋养细胞增殖与凋亡,低浓度的TNF-α可促进细胞增殖,对细胞凋亡无影响;而高浓度的TNF-α则抑制细胞增殖,引起细胞凋亡。在细胞周期时相分布上,TNF-α对滋养细胞的细胞周期G2期细胞向G1期移行有一定的阻断作用。滋养细胞增殖与凋亡平衡失调,胎盘发育障碍,不利于胚胎的生长,引起自然流产,为不明原因自然流产的发病机制的研究提供了新的理论依据。3.不同浓度的TNF-α对滋养细胞的增殖活性和细胞凋亡产生的作用程度不同,细胞增殖与细胞凋亡与TNF-α浓度之间表现明显的量效关系。通过检测孕妇体内TNF-α水平,对预测有RSA的孕妇再次发生自然流产的风险、先兆流产结局及治疗不明原因RSA效果具有重要应用价值。4.在细胞凋亡早期,使用AnnexinV-FITC/PI双染法检测早期细胞凋亡,较PI法敏感性高,为检测细胞凋亡提供了实验依据。5.TNF-α促进分泌HCG的功能,但其确切的调节机制尚有待于进一步探讨。