论文摘要
背景高脂血症能加速肾脏病进展的观点已被越来越多的学者所证实,但大多研究主要集中在高胆固醇血症与肾功能损害的关系。近年来有证据提示极低密度脂蛋白（very low-density lipoprotein,VLDL）可能参与肾小球硬化的发病过程中。脂质积聚和泡沫细胞形成被认为是脂质介导的肾小球和小管间质损害的特征。体外实验证实VLDL可诱导系膜细胞变为泡沫细胞。然而VLDL诱导系膜细胞内脂质积聚及导致肾损害的机制目前还不是很清楚。有研究显示表达在动脉壁的脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase,LPL）可通过其酶解作用和分子桥作用促进富含甘油三酯的脂蛋白的摄取,促进动脉粥样硬化的形成。肾小球系膜细胞也可表达脂蛋白脂酶,但关于它在肾脏的病理生理作用罕有研究。从人类和动物实验的许多观察强烈提示脂质介导的肾损害的发病机制与动脉粥样硬化的发病机制有许多相似之处,那么在肾小球系膜区表达的LPL能否发挥类似的作用促进脂质肾损害的进展值得探讨。本研究旨在探讨LPL在人系膜细胞摄取VLDL中的作用及可能的机制;并进一步观察与此相关的一些病理生理效应,就LPL在VLDL介导肾损害中的作用机制进行探讨。方法本研究使用人肾小球系膜细胞系（HMCLs）为研究对象。1 LPL在系膜细胞摄取VLDL中的作用通过过表达和抑制两方面的实验进行探讨:（1）将携带野生型人LPL基因（hLPLwt）,无活性的突变型人LPL基因（hLPL194）和对照人碱性磷酸酶基因（hAP）的重组腺病毒转染人肾小球系膜细胞（HMCLs）,建立高表达活性型和非活性型脂蛋白脂酶的HMCLs。（2）Orlistat（奥利司他）是一种内源性LPL脂酶活性的抑制剂,用于LPL酶活性阻断试验。Heparinase（肝素酶）是一类能特异性裂解肝素和类肝素主链糖苷键的酶,能阻断LPL分子桥作用的发挥。抗LDLr和LRP抗体被用于封闭脂蛋白受体。（3）RT-PCR、细胞免疫化学和放射性同位素脂质体底物法分别检测LPLmRNA、蛋白和酶活性的水平;油红0染色和酶法分别定性和定量检测细胞内脂质沉积情况;GPO Trinder法检测细胞上清中甘油的含量。2 LPL在VLDL诱导的系膜细胞损伤中作用的探讨:（1） LPL的过表达和抑制通过上述类似的方法实现。（2）MTT法检测VLDL对HMCLs增殖的影响;实时荧光定量RT-PCR和ELISA法检测HMCLs MCP-1 mRNA和蛋白表达的水平;通过HMCLs在高VLDL刺激后与THP-1单核细胞的共孵育,检测了单核细胞的趋化情况。结果1 LPL在系膜细胞摄取VLDL中的作用:（1） VLDL能诱导系膜细胞转变为泡沫细胞,且在一定范围内具有时间和浓度依赖性。在此种条件下,细胞内积聚的脂质以甘油三酯为主。（2）人肾小球系膜细胞可表达脂蛋白脂酶,并具有活性。（3）活性型和非活性型LPL过表达实验显示:①三种重组腺病毒感染HMCLs,LPL活性检测显示:感染Ad-hLPLwt的HMCLs细胞上清液中LPL活性较对照组明显升高（40.5±0.57U/L versus 1.35±0.15 U/L,P＜0.01）,而Ad-hLPL194组LPL活性与对照组无显著差异（1.48±0.12 U/L versus 1.35±0.15 U/L,P＞0.05）。本结果说明HMCLs能被重组腺病毒感染并有效表达LPL。②重组腺病毒感染的HMCLs孵育在高VLDL（40μg/ml）环境中6小时后,油红0染色显示:对照组细胞内几乎见不到红染的脂质颗粒沉积,而Ad-hLPLwt组细胞内可见许多粗大红色颗粒,Ad-hLPL194组细胞内仅见一些散在细小红色脂质颗粒沉积。酶法分析示Ad-hLPLwt组和Ad-hLPL194组细胞内积聚的甘油三酯较对照组明显增多（109.11±5.01μg/mg protein and 36.33±2.64μg/mg protein versus23.98±3.23μg/mg protein,P＜0.01 and P＜0.05）,三组的细胞内胆固醇成分无显著差异（P＞0.05）。③三组细胞上清中甘油的测定显示Ad-hLPLwt组细胞上清中甘油含量较Ad-hAP对照组明显增多（P＜0.01）,而Ad-hLPL194组和Ad-hAP对照组细胞上清中甘油含量无明显差别。（4）LPL酶活性阻断试验显示:①Orlistat剂量（0.1-10μM）依赖性地抑制了系膜细胞LPL的活性。②Orlistat剂量依赖性地抑制了VLDL诱导的细胞内甘油三酯的积聚。10μM Orlistat组细胞内甘油三酯含量较对照组明显下降（34.67122±0.8934μg/mg protein versus 84.4054±1.7319μg/mg protein,P＜0.01）。③Orlistat剂量依赖性地减少了细胞上清中甘油的含量。（5） LPL分子桥阻断试验显示:预孵育heparinase的HMCLs组与对照组比较,在较高的VLDL刺激时,轻度减少了细胞内甘油三酯的积聚。LDLr和LRP的封闭未明显减少VLDL诱导的细胞内甘油三酯的积聚。2 LPL在VLDL诱导的系膜细胞损伤中作用的探讨:（1）在一定范围内,VLDL可时间剂量依赖性地促进系膜细胞的增殖和上调系膜细胞MCP-1的表达,继而增加系膜细胞对THP-1单核细胞的趋化。（2）LPL过表达实验显示:①相同条件的脂质处理后,Ad-hLPLwt组细胞上清较对照组对HMCLs的增殖作用明显增强（0.2282±0.0168 versus 0.1805±0.0254,P＜0.05）,Ad-hLPL194组和Ad-hAP组之间比较无显著差异（0.1825±0.0298versus 0.1805±0.0254,P=0.051）。②与Ad-hAP对照组相比,Ad-hLPLwt组细胞MCP-1 mRNA表达上调39%（P＜0.05）,蛋白表达也明显上调（为对照的2.18倍,P＜0.01）。Ad-hLPLwt组对THP-1单核细胞的趋化能力最强,为对照组的1.69倍（P＜0.05）。Ad-hLPL194组和Ad-hAP组两者之间无显著差异。（3）LPL酶活性阻断试验显示:①HMCLs在100μg/ml VLDL孵育24h,Orlistat可剂量依赖性地抑制VLDL对HMCLs细胞的增殖效应,10μM组与DMSO对照组相比,系膜细胞增殖下降30%（P＜0.05）。②Orlistat可剂量依赖性地抑制VLDL刺激的HMCLs细胞MCP-1mRNA表达和蛋白的分泌。（4）VLDL能时间（0-16h）和剂量（0-100μg/ml）依赖性地轻度上调系膜细胞LPL的表达。结论（1）VLDL能诱导系膜细胞转变为泡沫细胞,且具有时间和浓度依赖性。在此种条件下,细胞内积聚的脂质以甘油三酯为主。（2）人肾小球系膜细胞可表达脂蛋白脂酶,并具有活性。（3）LPL在人系膜细胞摄取VLDL的过程中具有重要作用,其中酶的活性是主要方面。（4）VLDL在一定范围内能时间剂量依赖性地刺激系膜细胞增殖和MCP-1上调,在这一过程中LPL可能发挥着重要作用。（5）VLDL在一定范围内能时间剂量依赖性地轻度上调系膜细胞LPL的表达。这些结果提示LPL可能作为一个重要的因素参与富含甘油三酯的脂蛋白介导的脂质肾损害的发生和发展。