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IL-24与endostatin双基因联合治疗肝癌的实验研究

2020-12-11阅读(768)

IL-24与endostatin双基因联合治疗肝癌的实验研究

论文摘要

原发性肝细胞肝癌（Primory Hepatocellular Carcinoma, PHC）是我国常见的恶性肿瘤之一,是肝脏常见的富血管性恶性肿瘤,具有生长快、转移早和死亡率高的特性,也是一种强的血管依赖性肿瘤。大部分肝癌患者就诊时已是晚期,不能手术切除,其它治疗方法疗效都不理想。近年来,恶性肿瘤的基因治疗研究己取得令人鼓舞的研究成果,是继手术、放疗、化疗、免疫治疗之后的第五种治疗模式,是恶性肿瘤最具潜力的治疗方法之一。肿瘤基因治疗是目前肿瘤基础研究的热点。选择合适的靶基因和表达载体是基因治疗的关键。肿瘤基因治疗的研究方向主要是寻目的基因和探索多基因联合导入生物体内治疗肿瘤,以获得最佳治疗效果。Interleukin-24（IL-24）基因能够选择性诱导多种肿瘤细胞凋亡进而抑制肿瘤细胞生长,同时具有间接的抗血管生成的活性,具有较好的抗肿瘤潜能,而对正常的细胞则无影响。Endostatin可直接诱导内皮细胞凋亡,抑制血管内皮细胞增殖,抑制肿瘤新生血管形成,进而抑制肿瘤生长。选择pIRES作为两种基因的共表达载体,构建pIRES-IL-24-ES双基因真核分泌表达载体。我们将两基因真核分泌表达载体转染NIH3T3成纤维细胞,经过筛选后稳定表达,培养后将成纤维细胞转移到裸鼠腹腔,使导入的IL-24和Endostatin基因同时表达,联合治疗肝细胞癌,以探索联合肿瘤基因治疗的疗效。研究目的：构建真核双基因分泌表达载体pIRES-IL-24-ES,研究IL-24、endostatin双基因联合治疗肝细胞癌的效果。研究方法与结果：1.分离人胎肝组织,提取总RNA,用RT-PCR扩增出人IL-24和Endostatin全cDNA序列,经过基因测序,结果与GeneBank比对完全一致。选用高效真核双基因分泌表达载体pIRES,分别重组构建pIRES-IL-24, pIRES-ES, pIRES-IL-24-ES真核分泌表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定,证明所要表达的基因序列分别与GenBank报道的序列完全一致。2.将经鉴定正确的pIRES-IL-24-ES真核分泌表达载体,转染NIH3T3成纤维细胞,RT-PCR证明IL-24和Endostatin可在NIH3T3细胞表达,ELISA检测转染上清中有分泌表达的IL-24和Endostatin蛋白。3.将转染pIRES-ES质粒、pIRES-IL-24质粒和pIRES-IL-24-ES质粒的NIH3T3细胞培养上清,分别加入到脐静脉内皮细胞系ECV304培养液中,pIRES-ES组和pIRES-IL-24-ES组能够显著抑制内皮细胞ECV304的生长；而pIRES-IL-24组不能抑制内皮细胞的生长。将pIRES-IL-24质粒和pIRES-IL-24-ES质粒转染的HepG2肝癌细胞,能够显著抑制HepG2肝癌细胞的生长,FCM检测显著增加HepG2细胞的凋亡,pIRES-IL-24组与pIRES-IL-24-ES组在促进HepG2凋亡方面没有明显的差异。4.将pIRES-IL-24-ES质粒转染NIH3T3成纤维细胞,经过筛选后稳定表达,培养后将成纤维细胞转移到裸鼠腹腔,RT-PCR证明转染质粒能够在腹腔中表达。ELISA检测小鼠外周血和腹水,结果表明pIRES-IL-24、pIRES-ES与pIRES-IL-24-ES三种质粒表达的蛋白能同时分泌到外周血液和和腹水中,且表达量与单基因转移组表达量之间没有统计学差异。5.在接种HepG2肝癌细胞时,将小鼠分为四组：pIRES-IL-24-ES组、pIRES-IL-24组、pIRES-ES组、pIRES空载体对照组。分别在接种肝癌细胞后的0、7天,将稳定转染pIRES-IL-24-ES、pIRES-IL-24、pIRES-ES、pIRES质粒的NIH3T3成纤维细胞,分别移植到裸鼠腹腔中,于3、6、9、12、15天测量各组肿瘤的体积,比较各组肿瘤的大小,计算裸鼠的生存时间。统计学分析各组间肿瘤体积差别；免疫组织化学检测肿瘤微血管密度大小,判断对微血管的抑制情况；用RT-PCR凋亡相关基因的表达情况、ELISA检测外周血两种蛋白的表达量、FCM检测肝癌细胞凋亡。结论：1.成功构建了pIRES-IL-24-ES、pIRES-IL-24和pIRES-ES三种真核分泌表达载体。2.体外检测各载体分泌表达的蛋白具有很好的生物学活性。3建立HepG2肝癌裸鼠模型,将上述三种表达载体分别导入裸鼠腹腔内,都能够显著抑制肿瘤的生长,联合组治疗肝癌的效果明显好于单基因租和对照组。

论文目录

  • 中文摘要
  • ABSTRACT
  • 中英文缩写
  • 第一部分 前言
  • 第二部分 pIRES-IL-24-ES表达载体的构建与鉴定
  • 一、pIRES-IL-24表达载体的构建与鉴定
  • 1 材料和方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 实验结果
  • 2.1 IL-24 CDNA的扩增
  • 2.2 pGEM-T-IL-24的酶切鉴定
  • 2.3 pGEM-T-IL-24序列测定结果
  • 2.4 pIRES-IL-24鉴定
  • 3 讨论
  • 4 结论
  • 二、pIRES-IL-24-ES表达载体的构建与鉴定
  • 1 材料和方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 实验结果
  • 2.1 ES基因的RT-PCR扩增
  • 2.2 ES的测序结果
  • 2.3 pIRES-ES重组表达载体的鉴定
  • 2.4 pIRES-IL-24-ES重组表达载体的鉴定
  • 3 讨论
  • 4 结论
  • 第三部分 pIRES-IL-24-ES表达载体蛋白活性的测定
  • 1 材料和方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 实验结果
  • 2.1 IL-24和ES在NIH3T3细胞转录水平的表达
  • 2.2 ELISA检测IL-24和ES表达的蛋白
  • 2.3 Western blot检测IL-24与ES的表达
  • 2.4 IL-24对肝癌细胞凋亡的影响
  • 2.5 RT-PCR检测IL-24对肝癌细胞凋亡基因表达的影响
  • 2.6 ES对ECV304内皮细胞的影响
  • 2.7 FCM检测ECV304内皮细胞的凋亡
  • 3 讨论
  • 4 结论
  • 第四部分 IL-24和ES基因联合治疗小鼠肝癌的实验研究
  • 1 材料和方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 实验结果
  • 2.1 脂质体转染条件的优化
  • 2.2 重组质粒转染NIH3T3细胞及阳性克隆筛选
  • 2.3 检测肿瘤凋亡和抗凋亡基因mRNA表达
  • 2.4 ELISA检测裸鼠外周血中IL-24和ES表达量
  • 2.5 免疫组织化学检测肿瘤血管密度
  • 2.6 裸鼠肝肿瘤体积的观察
  • 2.7 实验小鼠生存期检测
  • 3 讨论
  • 4 结论
  • 展望
  • 参考文献
  • 附:技术路线图
  • 学习期间已（待）发表文章
  • 致谢
  • 附:两篇待发表的英文论文
  • 学位论文评阅及答辩情况表

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