论文摘要
甘蓝型油菜（Brassica napus）与双子叶模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）同是芸薹科植物,两者之间有着有着较近的亲缘关系。甘蓝型油菜有黑籽与黄籽之分,与黑籽相比起来黄籽甘蓝型油菜,具有种皮薄、含油量高、纤维素含量低,蛋白质含量高等优点。此外,由于黄籽甘蓝型油菜种籽中原花青素含量的下降,油菜籽初榨油和菜籽饼中的色素及多酚类抗营养剂就越低,从而提高了菜籽油和饼粕的经济价值。亲本物种甘蓝（B. oleracea）与白菜（B. rapa）中存在稳定的天然的黄籽材料,但甘蓝型油菜中没有。由于黄籽甘蓝型油菜品种少、种质资源有限、育种难度大,因此选育遗传性状优良的稳定的黄籽甘蓝型油菜是目前油菜育种工作的重要目标之一类黄酮途径是植物多种代谢途径中的重要的次生代谢途径,是公共苯丙烷途径的核心分支途径。黄酮类化合物（Flavonoids）则是类黄酮途径的主要产物,具有多种生物学功能。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物,它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方起着重要的作用。在芸薹科等植物中,植物器官表面颜色的重要成分为花青素（Anthocyanidins）、原花青素（proanthocyanidin, PA）与黄酮醇（Flavonol）。对拟南芥的研究表明,种皮色素的核心成分为原花青素,其主要集中积累在种籽的内种皮中有颜色的合点域。在对拟南芥中一些基因的突变研究时发现,由于抑制或者阻断了类黄酮途径,从而导致拟南芥种皮颜色由野生型的深褐色变成黄色,这种突变体称为透明种皮（transparent testa, tt）突变。拟南芥透明种皮8（AtTT8）基因编码一个bHLH（basic helix-loop-helix）型正调控转录因子,主要参与调控类黄酮物质的积累,在对原花青素在内种皮中的积累来说,TT8基因的调控是必要的,一般都在花青素苷和原花青素积累的细胞中诱导表达。会与TT2和TTG1联合形成一个三元转录因子复合物,同时能在TT2和TTGI之间起一个中介作用,调控如DFR、BAN等“晚期”的类黄酮合成途径的结构基因的表达,从而调控原花青素、花青素苷与种皮粘液在种皮中的积累。拟南芥u8突变体的种子黄色籽的透明种皮。本研究构建了芸薹属植物的RNA干扰（RNAi）和融合抑制子基因沉默技术（CRES-T）两种不同机理的基因沉默技术的植物表达载体,通过农杆菌介导法转化了黑籽甘蓝型油菜品种中双10号,对转基因效应与初步机理进行了研究,并对两种基因沉默方法进行了比较。1、克隆了611bp的芸薹属TT8基因家族的RNA干扰载体片段,将其反义片段、正义片段采用Ncol+SwaI、BamHl+XbaI分别插入到改进型植物RNA干扰基础载体pFGC5941M的启动子与间隔区、间隔区与终止子之间,形成11380bp的重组载体pFGC5941M-TT8I。通过多种PCR鉴定,该重组载体pFGC5941M-TT81构建是成功的。然后转化根癌农杆菌LBA4404,获得工程菌株。2、克隆了芸薹属TT8基因家族的CRES-T片段。利用XbaI+SacI双酶切将NT8-1CRE （1569bp）、OT8-2CRE （1569bp）分别亚克隆到本课题组创建的CRES-T平台载体pC2301M1SDPB上,形成了植物CRES-T表达载体pC2301M1SDPB-NT8-1CRE. pC2301M1SDPB-OT8-2CRE.利用Xbal+SacI双酶切将NT8-2CRE （1818bp）、RT8-2CRE （1447bp）分别亚克隆到本课题组创建的CRES-T平台载体pC2301M1SMPB上,形成了植物CRES-T表达载体pC2301M1SMPB-NT8-2CRE. pC2301M1SMPB-RT8-2CRE。通过多种PCR鉴定,这4个重组载体构建是成功的,然后转化根癌农杆菌LBA4404,形成了工程菌株。3、通过农杆菌介导法将RNA干扰载体pFGC5941M-TT81,的工程菌株转化甘蓝型油菜型的黑籽品种中双10号的下胚轴,并获得了20株抗Basta的再生植株。经多重PCR检测表明其中18株是转基因阳性植株。4、通过农杆菌介导法将CRES-T载体pC2301M1SDPB-NT8-]CRE pC2301M1SMPB-NT8-2CRE、pC2301M1SMPB-RT8-2CRE的工程菌株转化甘蓝型油菜型的黑籽品种中双10号的下胚轴,获得了32株抗Basta的再生植株。经多重PCR检测表明其中28株是转基因阳性植株。5、在RNA干扰载体转化中双10号的再生植株的生长发育过程中,系统地进行了性状调查。结果表明,RNA干扰抑制BnTT8基因家族后,转基因甘蓝型油菜在形态学、生长发育等主要性状上与CK植株没有明显差异。但种皮色素明显减少,种子颜色变浅,外观呈浅红色和红棕色,与CK的典型黑色对比明显。种子的饱满度普遍下降,种子变小,粒形偏离球形,粒重由CK的3.25g下降到平均2.64g左右,同时皮壳率从18.9%增加至20.4%,结实率由CK的85.3%下降到平均71.7%左右,荚角长度也由CK的7.6cm下降到6.1cm左右。6、对3个CRES-T载体转化中双10号的再生植株的生长发育和性状进行了系统调查。结果表明,CRES-T干扰抑制BnTT8基因家族后,转基因甘蓝型油菜在形态学、生长发育等主要性状上与CK植株没有明显差异。但种皮色素明显减少,种子颜色变浅,外观呈浅红色和红棕色,与CK的典型黑色对比明显。种子的饱满度普遍下降,种子变小,粒形偏离球形,粒重由CK的3.25g下降到平均2.58g左右,同时皮壳率从18.9%增加至22.4%,结实率由CK的85.3%下降到平均79.3%左右,荚角长度也由CK的7.6cm下降到7.2cm左右。RNA干扰和CRES-T两种方法的转基因效应均表明,芸薹属TT8基因可能同时参与调控种皮色素积累、种子发育、种胚色素积累等多个性状,抑制其表达后可以创造出种皮色素大大下降的转基因材料,但同时也会产生结实率和千粒重下降等副效应。对两种方法比较后发现一个有趣的现象,两种方法的效应除相似的一面以外,也有显著的不同。RNA干扰后种皮色素积累被抑制的程度比CRES-T稍强,但CRES-T后则产生了内种皮变厚、种皮栅栏层细胞变宽等结构变化。7、RT-PCR检测表明,RNA干扰转基因植株开花后20 d的种子中BnTT8家族总体和各成员的表达均被大幅抑制,在叶片中被完全抑制,BnTT8-2的抑制程度比BnTT8-1稍弱,与它们同RNA干扰片段的同源性相吻合。RT-PCR检测还表明,CRES-T转基因植株开花后20d的种子中BnTT8家族总体和各成员的表达也有一定下调,与拟南芥报道TT8能够反馈调节自身表达相一致。