左氧氟沙星单克隆抗体制备及鉴定

论文摘要

本研究旨在研制出高特异性的左氧氟沙星单克隆抗体,并通过对大量生产的左氧氟沙星单克隆抗体进行纯化、分子量测定、左氧氟沙星单克隆抗体的特异性及交叉反应等一系列的鉴定,来检测其单抗的特异性。其结果如下:1.本研究采用碳二亚胺法法将左氧氟沙星（LVL）分别与牛血清白蛋白（BSA）和卵清白蛋白（OVA）偶联,制备免疫抗原（LVL-BSA）和包被抗原（LVL-OVA）。经紫外扫描和SDS-PAGE电泳分析表明,LVL与载体蛋白BSA和OVA偶联计算分子结合比率分别为6:1和12:1。将偶联好的LVL-BSA免疫BALB/c小鼠,用间接ELISA测定抗体效价,免疫的6只小鼠血清抗体效价均达到了1:8 000,说明获得了较好的免疫效果。利用阳性血清再次通过的间接ELISA法检测载体蛋白的可行性,结果显示LVL-OVA作为包被抗原是可行的。2.用LVL-BSA免疫BALB/c小鼠6只,5次免疫后用间接ELISA法选择出细胞融合备用小鼠,采取杂交瘤建株技术,共获得3株能稳定分泌抗左氧氟沙星单克隆抗体的杂交瘤细胞株1E4、4F4和3G8。用体内诱生腹水法制备LVL-mAb,经鉴定,其间接ELISA效价细胞培养上清分别为1:1 000、1:500和1:640,腹水分别为1:6.4×103、1:4×103、1:3.2×103。亚型鉴定均为IgG1,亲和常数（Ka）分别为1.27×109L/mol。LVL-McAb与氧氟沙星、洛美沙星、环丙沙星的交叉反应率分别为100%、0.25%、0.06%与其他类抗生素无交叉反应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 左氧氟沙星的研究概况
• 1.1.1 左氧氟沙星的化学结构
• 1.1.2 左氧氟沙星的理化性质
• 1.2 左氧氟沙星的作用机理
• 1.3 左氧氟沙星的药动学特点
• 1.4 左氧氟沙星的毒副作用和耐药机理
• 1.4.1 左氧氟沙星的毒副作用
• 1.4.2 左氧氟沙星的耐药机理
• 1.5 氟喹诺酮类药物残留检测方法的研究进展
• 1.5.1 色谱法
• 1.5.2 光化学法
• 1.5.3 电化学法
• 1.5.4 微生物法
• 1.5.5 免疫检测技术
• 1.6 本研究的主要内容和技术路线
• 第二章 左氧氟沙星人工抗原的合成与鉴定
• 2.1 材料
• 2.1.1 仪器
• 2.1.2 药品和试剂
• 2.1.3 试验动物
• 2.2 方法
• 2.2.1 免疫抗原与包被抗原的合成
• 2.2.2 人工抗原鉴定
• 2.2.3 包被蛋白选择的可行性鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 人工抗原紫外扫描法鉴定结果
• 2.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳法鉴定结果
• 2.3.3 免疫小鼠血清抗体效价间接ELISA 检测
• 2.3.4 包被蛋白选择的可行性鉴定
• 2.4 讨论
• 2.4.1 人工抗原偶联方法的选择
• 2.4.2 人工抗原合成过程中透析时间的控制
• 2.4.3 偶联载体蛋白的选择
• 2.4.4 偶联比
• 2.4.5 动物免疫方法的选择
• 2.4.6 血清效价的检测方法的摸索
• 2.5 小结
• 第三章 左氧氟沙星的单抗制备及鉴定
• 3.1 材料
• 3.1.1 仪器和器材
• 3.1.2 药品和试剂
• 3.1.3 试验动物及细胞
• 3.2 方法
• 3.2.1 滋养层细胞的制备
• 3.2.2 SP2/0 骨髓瘤细胞悬液的制备
• 3.2.3 免疫脾细胞悬的制备
• 3.2.4 细胞融合
• 3.2.5 杂交瘤细胞的筛选
• 3.2.6 杂交瘤细胞的克隆
• 3.2.7 单克隆抗体的大量制备
• 3.2.8 杂交瘤细胞染色体鉴定
• 3.2.9 抗体纯化及分子量测定
• 3.2.10 单克隆抗体的鉴定
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 进行细胞融合的小鼠选择
• 3.3.2 杂交瘤细胞株的建立
• 3.3.3 杂交瘤细胞染色体鉴定
• 3.3.4 纯化后蛋白浓度和抗体效价测定
• 3.3.5 单克隆抗体亚型的鉴定及分子量
• 3.3.6 单克隆抗体亲和常数测定和特异性鉴定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 细胞融合
• 3.4.2 杂交瘤细胞的筛选
• 3.4.3 杂交瘤细胞的克隆
• 3.4.4 单克隆抗体的大量制备
• 3.4.5 杂交瘤细胞染色体鉴定
• 3.4.6 单克隆抗体亚型及腹水纯化
• 3.4.7 单克隆抗体亲和常数测定
• 3.4.8 单克隆抗体特异性分析
• 3.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介