耐受高用量消泡剂土霉素菌株的诱变筛选及其发酵工艺研究

论文摘要

土霉素是龟裂链霉菌（Streptomyces rimosus）产生的四环素类广谱抗生素,具有很好的抑菌效果。土霉素的发酵过程中,消泡剂的添加会对菌体自身及土霉素产生存在抑制作用,因此,选育耐消泡剂的菌株具有一定的现实意义。本文采用紫外诱变的方法,对菌株进行消泡剂耐受性筛选,共挑选187株菌落进行菌落初筛,得到效价高出0.1%（10倍）消泡剂对照的有83株菌株。对效价较高的菌株进行复试,最终得到1株耐受高用量消泡剂菌株。筛选到的耐受高用量消泡剂菌株在高消泡剂浓度（即10倍消泡剂浓度）下,仍然不影响菌株效价,而出发菌株在10倍消泡剂浓度下土霉素产量显著下降,下降了76.1%。将筛选得到的耐受高用量消泡剂菌株进行纯度检测,共统计了600个菌落,其中光秃菌落2个,褐色菌落1个,菌种纯度为99.5%。将该菌株连续传代4次,结果表明该菌株的传代比较稳定。对该菌株进行代谢稳定性考察,结果显示摇瓶各发酵时间的效价、pH值、葡萄糖含量和可溶性氨基氮含量均呈现较好的变化趋势。采用Plackett-Burman设计、陡坡爬升实验和Box-Behnken中心组合设计,对筛选得到的耐受高用量消泡剂土霉素菌株进行发酵培养基的响应面优化,从发酵培养基中的可溶性淀粉、黄豆饼粉、碳酸钙、硫酸铵、氯化钠、玉米浆、磷酸二氢钾、氯化钴8个影响因素中,筛选出豆粉、硫酸铵和氯化钴3个主要因素,并对其进行优化。优化所得最佳摇瓶发酵培养基配方为：黄豆饼粉2.74%、硫酸铵0.347%、氯化钴0.0131%、可溶性淀粉10%、碳酸钙0.5%、氯化钠0.5%、磷酸二氢钾0.05%、玉米浆1%、消泡剂0.01%。按此配方进行3次摇瓶发酵平行实验,其平均效价为优化前的103.4%。对筛选所得耐受高用量消泡剂土霉素菌株的各发酵条件进行实验研究,最终确定该菌株的最佳发酵条件为：种龄20～24 h、初始pH值6.5、发酵温度30℃、接种量10%、装液量40 mL、发酵周期144 h,按此发酵条件进行发酵实验3次,其平均效价为优化前的112.4%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 土霉素概述
• 1.1.1 土霉素的理化性质
• 1.1.2 霉素在临床上的应用
• 1.1.3 土霉素的药物残留以及休药期
• 1.2 龟裂链霉菌
• 1.3 消泡剂
• 1.3.1 泡沫的产生
• 1.3.2 泡沫的危害
• 1.3.3 消泡剂的选择
• 1.3.4 发酵常用消泡剂
• 1.4 链霉菌选育的研究进展
• 1.4.1 自然随机筛选
• 1.4.2 传统诱变方法
• 1.4.3 代谢调控育种
• 1.4.4 基因工程育种
• 1.5 研究内容
• 1.6 研究意义
• 第2章 耐受高用量消泡剂土霉素菌株的诱变选育
• 2.1 实验试剂与仪器
• 2.1.1 实验试剂
• 2.1.2 实验仪器
• 2.2 分析方法
• 2.2.1 pH的测定
• 2.2.2 菌体浓度的测定
• 2.2.3 葡萄糖浓度的测定
• 2.2.4 可溶性氨基氮的测定方法
• 2.2.5 土霉素摇瓶效价的测定方法
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 实验菌种
• 2.3.2 实验用培养基
• 2.3.3 培养条件
• 2.3.4 耐消泡剂菌株筛选流程
• 2.3.5 孢子悬液的制备
• 2.3.6 紫外诱变
• 2.3.7 消泡剂用量对菌株生产能力的影响
• 2.3.8 耐受高用量消泡剂土霉素菌株的筛选
• 2.3.9 菌种鉴定
• 2.3.10 菌种保藏
• 2.4 结果与讨论
• 2.4.1 最佳诱变剂量的确定
• 2.4.2 筛选用消泡剂用量的确定
• 2.4.3 耐受高用量消泡剂土霉素菌株的筛选
• 2.4.4 菌种鉴定
• 2.5 本章小结
• 第3章 耐受高用量消泡剂土霉素菌株培养基优化
• 3.1 实验试剂与仪器
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 实验菌种
• 3.2.2 实验用培养基
• 3.2.3 培养条件
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 Plackett-Burman实验
• 3.3.2 陡坡爬升实验
• 3.3.3 响应面分析实验
• 3.3.4 最佳培养基配方的确定及验证
• 3.4 本章小结
• 第4章 耐受高用量消泡剂土霉素菌株发酵条件研究
• 4.1 实验试剂与仪器
• 4.1.1 实验试剂
• 4.1.2 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 实验菌种
• 4.2.2 实验用培养基
• 4.2.3 发酵条件研究
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 种子培养时间对发酵的影响
• 4.3.2 初始pH值对发酵的影响
• 4.3.3 温度对发酵的影响
• 4.3.4 接种量对发酵的影响
• 4.3.5 溶氧对发酵的影响
• 4.3.6 剪切力对发酵的影响
• 4.3.7 发酵周期对发酵的影响
• 4.3.8 最佳发酵条件的确定及验证
• 4.4 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间所发表的论文
• 致谢