西北部分地区野大豆根瘤菌遗传多样性及系统发育的研究

论文摘要

从甘肃、陕西两省的4个采样点分离获得62株野大豆根瘤菌,分别用16S rDNA PCR-RFLP、BOX-PCR、16S rDNA全系列分析、持家基因recA、结瘤因子（nifH PCR-RFLP、nodA PCR-RFLP）多项分类技术对西北部分地区的野大豆进行遗传多样性及系统发育研究。根据16S rDNA PCR-RFLP及其序列测定结果表明,西北地区野大豆供试菌株共产生了6种16S rDNA酶切组合类型,其中基因型Ⅰ（AAAA）,由44株供试菌株组成,该酶切类型在4个采样点均有分布,共占供试菌种的比例约为70%,经测序基因型Ⅰ为中华根瘤菌属（Sinorhizobium）。16S rDNA PCR-RFLP及其序列测定表明6种16S rDNA酶切组合类型分别位于中华根瘤菌属（Sinorhizobium）,根瘤菌属（Rhizobium）,土壤杆菌属（Agrobacterium） 3个系统发育分支上。BOX-PCR分析表明,62株野大豆供试菌菌在40%的水平上聚在了一起,在49%的水平上62株菌被分成三个群;在83%的水平上,62株菌被分成了6个类群,6个类群的菌株组成与16S rDNA PCR-RFLP分析结果较为一致。但BOX-PCR与16S rDNA全序列比较其同源性较16S rDNA序列小。从而,证明BOX-PCR在种上鉴定的优势。从recA序列和16S rDNA全序列系统发育两个系统发育树中可以知道,西北地区野大豆根瘤菌菌株的16S rDNA全序列系统发育与持家基因recA序列系统发育的结果有很好的一致性。但是也存在一定的差异,其他代表株recA序列与最近系统发育位置的参比菌株同源性均小于16S rDNA全序列的系统发育分析结果。16S rDNA可以提供可靠的属间系统发育信息,但是属内的遗传关系可能被种间的遗传重组打乱。nodA的研究结果表明,位于不同种属的野大豆根瘤菌拥有相对专一的nodA基因,所有供试菌株的nodA基因都位于系统进化树Sinorhizobium分支上,代表菌株CCNWSX1016、CCNWSX1108、CCNWSX1182分布E. fredii和E. xinjiangense的分支上,菌株CCNWSX1016与E. Fredii和E. xinjiangense进行序列相似性比较,它们之间的序列相似性分别为100%,98.66%。nifH的研究结果表明,野大豆根瘤菌具有相对专一的nifH基因。序列分析表明, nifH基因都位于系统进化树Sinorhizobium分支上,代表菌株CCNWSX1108与CCNWSX1182的序列相似性为99.58%,二者与S. kummerowiae关系最近,序列相似性同为86.32%;菌株CCNWSX1016与S. fredii关系最近,序列相似性为99.14%。综上所述,本研究结果表明西北部分地区野大豆根瘤菌的遗传多样性较为丰富,但主要是中华根瘤菌属（Sinorhizobium）。该项研究为丰富野大豆根瘤菌的资源多样性,确定其系统分类地位提供了依据;为选育耐旱和抗逆性强的高效固氮大豆根瘤菌奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 引言
• 1.2 根瘤菌的分类
• 1.3 根瘤菌多样性进展
• 1.3.1 根瘤菌多样性研究进展
• 1.3.2 特定片段的酶切图谱或序列的多态性分析
• 1.4 本研究的立题依据及研究意义
• 1.4.1 选题的依据
• 1.4.2 野大豆根瘤菌的国内外研究进展
• 1.4.3 西北地区野大豆根瘤菌的研究目的及意义
• 第二章 16S PCR-RFLP 分析及持家基因系统发育研究
• 2.1 16S rDNA PCR-RFLP 系统发育研究
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.2 结果与分析
• 2.1.3 16S rDNA-RFLP 结果分析
• 2.1.4 16S rDNA 全序列系统发育学分析
• 2.2 recA 基因片段系统发育学分析
• 2.2.1 DNA 提取与recA PCR 扩增
• 2.2.2 recA 基因片段系统发育学分析
• 第三章 BOX-PCR 分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌株
• 3.1.2 模板DNA 提取
• 3.1.3 PCR 扩增引物
• 3.1.4 主要试剂
• 3.1.5 BOX-PCR 扩增体系
• 3.1.6 扩增片段的检测
• 3.2 结果与分析
• 第四章 结瘤基因（nodA） 和固氮基因（nifH）的PCR-RFLP 分析及系统发育研究
• 4.1 结瘤基因（nodA） 和固氮基因（nifH） 限制性片段长度多样性（RFLP） 研究
• 4.1.1 材料与方法
• 4.1.2 结果与分析
• 4.2 no dA 和nifH 基因片段系统发育研究
• 4.2.1 菌株
• 4.2.2 nodA 和nifH 基因片段序列测定结果和系统发育学分析
• 第五章 供试菌株的结瘤试验
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 菌株
• 5.1.2 回接方法
• 5.2 结果与分析
• 第六章 结论与讨论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介