大豆异黄酮激活PPARγ促进人前列腺癌DU-145细胞凋亡的作用及其机制

论文摘要

前列腺癌是老年男性生殖系统常见的恶性肿瘤之一。膳食、营养因素在前列腺癌的发生、发展过程中起着重要作用，其中大豆及其制品对前列腺癌的保护作用备受关注，流行病学研究表明大豆及其制品的摄入量与前列腺癌的发病风险呈负相关。大豆异黄酮（soy isoflavone,SI）属于多酚类化合物（polyphenols），是存在于大豆中的植物化合物（phytochemicals）成分，大豆异黄酮主要包括染料木黄酮（genistein，GEN）和大豆苷元（daidzein,DAI）两种。大量体外实验研究发现，大豆异黄酮具有抑制前列腺癌细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制癌细胞侵袭转移等抗肿瘤效应，提示大豆异黄酮可能是大豆及其制品抗前列腺癌作用的主要活性成分。细胞凋亡是多基因调控的程序化死亡过程，诱导肿瘤细胞凋亡是控制恶性肿瘤生长的重要策略之一。大量研究证实大豆异黄酮诱导前列腺癌细胞凋亡与Bax、Bcl-2、P53、Akt、NF-κB等基因表达水平变化有关，但大豆异黄酮调节这些细胞凋亡相关基因表达的确切分子机制还未完全阐明。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs）是核受体（nuclear receptor）超家族的成员之一。PPARs作为配体依赖性激活的核转录因子被相应的配体激活，和靶基因启动子上的过氧化物酶体增殖物反应元件（peroxisomeproliferator responsive element,PPRE）结合，以调控靶基因转录表达水平，进而参与细胞多种重要生理功能的调控。PPARs包括PPARα、PPARβ和PPARγ三种亚型，由于PPARγ与肥胖、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化、糖尿病等代谢性疾病关系密切而成为研究热点。最近研究发现，多种不同器官来源的肿瘤细胞中存在PPARγ表达，PPARγ与肿瘤发生发展的关系开始受到学者关注。已有大量实验研究证实，许多外源性的PPARγ配体如噻唑烷二酮类（thiazolidinediones,TZDs）抗糖尿病药物如罗格列酮（rosiglitazone，RGZ）、曲格列酮（Troglitazone,TGZ）等具有抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞侵袭转移等抗肿瘤效应，因此PPARγ配体可能是潜在的肿瘤化学防治药物，PPARγ被认为是肿瘤治疗的新靶点。2003年，大豆异黄酮被首次证实是PPARγ的天然配体。近年来，PPARγ信号途径在大豆异黄酮降血脂、抗糖尿病等多种生物学效应中的作用开始受到重点关注。已有研究发现，GEN可通过激活PPARγ信号途径降血脂、降血糖。但迄今尚未见大豆异黄酮抗前列腺癌的作用是否与PPARγ信号通路有关的研究报道。本研究以人前列腺癌DU-145细胞为研究对象，采用报告基因荧光素酶表达检测、免疫荧光细胞化学染色、TUNEL染色、Annexin Ⅴ/PI双标记流式细胞术分析、蛋白免疫印迹（Western blot）、Caspase3活性检测等技术方法，对比观察研究两种主要大豆异黄酮成分GEN、DAI和PPARγ激动剂RGZ（阳性对照药物）单独或联合PPARγ选择性拮抗剂GW9662处理DU-145细胞，PPARγ转录活性、细胞凋亡和PTEN、bcl-2、bax、p53等凋亡相关基因表达水平，以及凋亡相关蛋白酶Caspase3活性的变化，以期探讨大豆异黄酮对前列腺癌细胞凋亡的影响及其与PPARγ信号途径的关系。主要研究结果和结论如下：1、报告基因荧光素酶分析检测结果显示：GEN、DAI和RGZ单独处理均可明显增强PPRE-TK-Luc质粒转染的DU-145细胞中报告基因荧光素酶的表达水平（P＜0.05），且GEN、DAI对报告基因表达的增强作用存在剂量依赖性趋势。PPARγ选择性拮抗剂GW9662分别与GEN、DAI、RGZ联合处理时，DU-145细胞中荧光素酶的表达水平较对应的单独处理组显著下降（P＜0.05），并与对照组无显著差异。2、PPARγ免疫荧光细胞化学染色检测结果显示：对照组的DU-145细胞中PPARγ（绿色荧光）主要分布于胞浆中，胞核中很少，GEN、DAI和RGZ处理组的细胞中PPARγ在胞浆和胞核均有分布，而GW9662分别与GEN、DAI、RGZ联合处理组的细胞中PPARγ分布特征与对照组相似，表明GEN、DAI和RGZ具有促进PPARγ核移位的作用，但这种促进作用可被GW9662所抑制。3、TUNEL染色检测细胞凋亡结果显示：对照组的DU-145细胞中未见胞核呈蓝绿色荧光的凋亡细胞，GEN、DAI和RGZ单独处理组的细胞中均可见一定数量的胞核呈蓝绿色荧光的凋亡细胞，而GW9662分别与GEN、DAI、RGZ联合处理细胞时，胞核呈蓝绿色荧光的凋亡细胞数量较对应的单独处理组减少。4、Annexin Ⅴ/PI双标记流式细胞分析定量检测细胞凋亡结果显示：GEN、DAI和RGZ单独处理DU-145细胞48h后，细胞凋亡率较对照组显著增加（P＜0.05），而GW9662分别与GEN、DAI、RGZ联合处理细胞时，各组细胞凋亡率较对应的单独处理组明显下降（P＜0.05）。5、免疫印迹检测细胞凋亡相关基因蛋白表达水平结果显示：GEN、DAI和RGZ均可显著增加DU-15细胞bax、 p53和PTEN蛋白表达水平（P＜0.05），并明显降低bcl-2蛋白表达水平（P＜0.05），而GW9662明显削弱GEN、DAI和RGZ对DU-145细胞PTEN、bcl-2、bax、p53等蛋白表达水平的增加或降低作用（P＜0.05）。6、细胞凋亡相关蛋白酶活性检测结果显示：GEN、DAI和RGZ单独处理DU-145细胞48h后，Caspase3的活性较对照组均有显著升高（P＜0.05），而GW9662分别与GEN、DAI、RGZ联合处理细胞时，Caspase3的活性较对应的单独处理组明显降低（P＜0.05）。以上研究结果提示：人前列腺癌DU-145细胞中存在PPARγ表达，大豆异黄酮的两种主要成分GEN和DAI均可促进DU-145细胞PPARγ的核转位，增加PPARγ的转录活性，并引起细胞凋亡相关基因PTEN、bcl-2、bax、P53等蛋白表达水平，以及凋亡相关蛋白酶Caspase3的活性发生明显变化，进而促进DU-145细胞凋亡，而PPARγ特异性抑制剂GW9662可明显抑制GEN、DAI对DU-145细胞的上述效应。结果表明大豆异黄酮激活PPARγ是其诱导前列腺癌细胞凋亡的分子机制之一。

论文目录

• 英文缩写览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 前言
• 材料和方法
• 实验结果
• 讨论
• 全文小结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 过氧化物酶体增殖物激活受体γ与肿瘤细胞凋亡的研究进展
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间撰写论文