论文摘要
研究背景内皮祖细胞是1997年发现的在成人体内能分化为内皮细胞的前体细胞,存在于骨髓及外周血中。内皮祖细胞主要参与内皮细胞修复即血管的再内皮化以及参与血管新生,由此近年来内皮祖细胞在血管病变中的作用越来越受到重视。糖尿病血管病变的重要发病机制是内皮细胞功能受损及凋亡。血管内皮层完整性遭到破坏,炎性细胞浸润至内皮下层促进动脉粥样硬化的发生发展,因此内皮功能受损被视为糖尿病血管病变的始动因素。正常状态下,受损的内皮由周边内皮及循环中的内皮祖细胞分化为内皮来修复,保持内皮层的完整性,一旦内皮祖细胞受损,内皮损害和修复之间的平衡被打破,内皮层的完整性遭到破坏,由此发生动脉粥样病变,因此内皮祖细胞在糖尿病血管病变中具有重要作用。已有研究证实糖尿病时循环内皮祖细胞数量和功能均受损害,而循环内皮祖细胞来源于骨髓,由此我们推测糖尿病时骨髓内皮祖细胞可能也受损。我们已知内质网应激介导的β细胞凋亡是糖尿病发病的重要机制,由此我们推测内质网应激可能介导内皮祖细胞的凋亡参与糖尿病血管病变的发病。迄今尚无观察糖尿病对骨髓内皮祖细胞的凋亡有无影响及其机制的研究,本研究的目的旨在:目的1.建立糖尿病大鼠模型。2.研究大鼠骨髓内皮祖细胞体外分离、诱导、培养及鉴定的方法。3.检测糖尿病大鼠和正常大鼠骨髓内皮祖细胞凋亡率,明确糖尿病时骨髓内皮祖细胞是否受损。4.检测糖尿病大鼠和正常大鼠骨髓内皮祖细胞内质网应激标志物GRP78及内质网应激特异性凋亡因子—caspase-12活性,以了解内质网应激是否参与介导糖尿病时骨髓内皮祖细胞的凋亡。方法1.糖尿病（diabetes mellitus,DM）大鼠模型的制备雄性Wistar大鼠27只,随机分为2组:对照组12只,DM组15只。标准大鼠饲料喂养1周后,禁食12h,DM组大鼠给以腹腔内注射链脲佐菌素（STZ）65mg/kg,对照组大鼠注射等量柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液。糖尿病大鼠成模标准为:连续2次空腹血糖＞16.7mmol/L。未达成模标准者剔除。DM组大鼠血糖升高后,饲以高脂高糖饮食,对照组则给予标准饮食喂养。2.大鼠骨髓源内皮祖细胞的培养、鉴定。2.1大鼠骨髓内皮祖细胞的培养大鼠拉颈处死后无菌状态下分离股骨胫骨,将骨髓细胞以无菌PBS液完全冲洗至离心管,应用大鼠淋巴细胞分离液（LTS-1083）以密度梯度离心法（2 000rpm,30 min）分离单个核细胞。洗涤后以含20%胎牛血清的M199培养液重悬,接种于培养瓶中,37℃、5%CO2条件下培养。细胞培养24 h（早期贴壁）后收集未贴壁细胞离心后以选择性培养基（M199培养基加入20%胎牛血清,100μg/mL链霉素,100U/ml青霉素,40 ng/mL大鼠血管内皮生长因子（VEGF,Peprotech,USA）,2 ng/mL人成纤维细胞生长因子（FGF,Peprotech,USA）,10 ng/mL人表皮细胞生长因子（EGF,Peprotech,USA）以及10U/mL肝素）重悬计数,1×106/mL转入包被0.1%明胶（Sigma,USA）的24孔板和培养瓶中二次贴壁,4天后换液,培养至第7天鉴定。2.2大鼠骨髓EPCs的鉴定细胞在含DiI-ac-LDL（2.4μg/mL）的培养液中37℃避光孵育1h,然后以2%的多聚甲醛固定10min,PBS液漂洗后再加FITC-UEA-1（10μg/mL）避光孵育1h。PBS液漂洗后在荧光显微镜下观察,显示红色荧光的为ac-LDL阳性细胞,显示绿色荧光的为UEA-1阳性细胞,显示双荧光阳性（黄色）的细胞被认为是EPCs。3.流式细胞仪检测大鼠骨髓源内皮祖细胞凋亡率ANEXIN V/PI凋亡检测试剂盒流式细胞仪检测凋亡。4.RT-PCR检测GRP78、CASPASE-12基因表达结果1.大鼠基本情况及血糖检测实验过程中,对照组大鼠精神状态良好,体重增加明显,反应敏捷,毛色白而光泽。DM组大鼠出现多食、多饮、多尿和消瘦等症状,体重增加迟缓,精神萎靡,皮毛无光泽,部分出现烂尾、白内障等。最终共23只完成实验,其中对照组12只,DM组11只。注射STZ之前,对照组与DM组血糖无明显差异（P＞0.05）。注射STZ 1周后,DM组血糖明显高于对照组（P＜0.01）,并持续至实验末。2.大鼠骨髓源内皮祖细胞培养、鉴定早期贴壁细胞呈毛发样生长,多为骨髓基质细胞。二次贴壁的细胞大多在3天左右伸展成梭形或纺锤形。7～10天增殖速度加快可见内皮细胞特异性条索状结构。2周左右细胞可达80～90%融合,大部分细胞呈多角形。80%以上细胞可同时吸收DiI-ac-LDL结合FITC-UEA-1即鉴定为内皮祖细胞。3.流式细胞仪检测大鼠骨髓源内皮祖细胞凋亡率DM大鼠骨髓源内皮祖细胞凋亡率明显高于对照组（20.3±4.64%vs.11.2±2.85,P＜0.05）。4.RT-PCR检测GRP78、CASPASE-12 mRNA表达1)GRP78mRNA表达:DM组内皮祖细胞GRP78mRNA表达均较对照组明显增高（0.64±0.07%vs.0.43±0.05%,P＜0.05）。2)CASPASE-12 mRNA表达:DM组内皮祖细胞CASPASE-12 mRNA表达均较对照组明显增高（0.56±0.09%vs.0.36±0.04,P＜0.05）。结论1)糖尿病大鼠骨髓源内皮祖细胞凋亡率明显增加。2)DM大鼠骨髓源内皮祖细胞GRP78及CASPASE-12 mRNA表达增加,提示内质网应激参与介导糖尿病大鼠骨髓源内皮祖细胞凋亡,可能在糖尿病血管病变的发生发展中起重要作用。研究背景内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ER stress）是内质网功能紊乱时出现错误折叠与未折叠蛋白在腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的状态,对决定应激细胞的结局如抵抗、适应、损伤或凋亡有重要作用。一定程度的内质网应激因能激活保护机制例如分子伴侣表达而有细胞保护作用,应激过强时,保护机制不能与损伤抗衡,内质网应激可通过caspase-12独立地介导细胞凋亡。内质网应激使caspase-12活化,继而激活下游caspase,导致细胞凋亡,内质网应激反应性细胞凋亡是不同于死亡受体介导或经线粒体介导的一种新的细胞凋亡途径,caspase-12作为凋亡起始因子发挥了关键作用。有研究已证实内质网应激介导的凋亡参与胰岛β细胞的凋亡,是糖尿病发病的重要机制。内皮祖细胞在糖尿病血管病变中有重要作用,研究表明糖尿病时循环内皮祖细胞数量及功能均受损,我们在体内实验也发现其在糖尿病大鼠骨髓中凋亡率明显增加,同时内皮祖细胞内质网应激激活,结合内皮祖细胞具有内皮细胞修复以及参与血管新生的作用,我们推测内皮祖细胞凋亡增加很可能在以动脉粥样硬化为重要特征的糖尿病血管病变中发挥重要作用。那么内质网应激介导的凋亡是否参与了高糖诱导的大鼠骨髓源内皮祖细胞的凋亡呢?本工作拟通过高糖刺激体外培养的大鼠骨髓源内皮祖细胞,观察高糖对其凋亡的影响及内质网应激特异凋亡因子caspase-12是否参与介导其凋亡,以期为糖尿病血管病变的预防和治疗提供新的机制和靶点。目的1.观察高糖培养对大鼠骨髓EPCs凋亡的影响。2.观察高糖培养是否激活大鼠骨髓EPCs内质网应激反应。3.观察CASPASE-12介导的内质网应激途径是否在高糖诱导的大鼠骨髓EPCs凋亡过程中发挥重要作用。方法1.大鼠骨髓内皮祖细胞（Bone Marrow-derived Endothelial Progenitor Cells,BM-EPCs）的培养、鉴定1.1骨髓EPCs的分离、培养6周龄雄性体重250—300克Wistar大鼠购自山东大学动物实验中心,拉颈处死后无菌条件下取出四肢长骨,将骨髓细胞以无菌PBS液完全冲洗至离心管用大鼠淋巴细胞分离液（LTS-1083）以密度梯度离心法（2 000 rpm,30 min）分离单个核细胞。洗涤后以含20%胎牛血清的M199培养液重悬,接种于培养瓶中,37℃、5%CO2条件下培养。细胞培养24 h（早期贴壁）后收集未贴壁细胞离心后以选择性培养基（M199培养基加入20%胎牛血清,100μg/mL链霉素,100U/ml青霉素,40 ng/mL大鼠血管内皮生长因子（VEGF,Peprotech,USA）,2 ng/mL人成纤维细胞生长因子（FGF,Peprotech,USA）,10 ng/mL人表皮细胞生长因子（EGF,Peprotech,USA）以及10U/mL肝素）重悬计数,1×106/mL转入包被0.1%明胶（Sigma,USA）的24孔板和培养瓶中二次贴壁,4天后换液,培养至第7天鉴定。1.2 EPCs的鉴定细胞在含DiI-ac-LDL（2.4μg/mL）的培养液中37℃避光孵育1h,然后以2%的多聚甲醛固定10min,PBS液漂洗后再加FITC-UEA-1（10μg/mL）避光孵育1h。PBS液漂洗后在荧光显微镜下观察,显示红色荧光的为ac-LDL阳性细胞,显示绿色荧光的为UEA-1阳性细胞,显示双荧光阳性（黄色）的细胞被认为是EPCs。2.流式细胞仪测定不同浓度糖培养BM-EPCs凋亡率骨髓EPCs给予不同浓度高糖（5mmol/L、12.5mmol/L及25mmol/L）刺激24h,流式细胞仪检测细胞凋亡率3.Western-blot测定不同浓度糖培养骨髓EPCs GRP78、CASPASE-12、CASPASE-3蛋白表达改变4.流式细胞仪测定给予或未给予caspase-12抑制剂（Z-ATAD-FMK 5uM）预处理后高糖（25mmol/L）培养骨髓EPCs凋亡率5.Western-blot测定给予或未给予caspase-12抑制剂（Z-ATAD-FMK 5uM）预处理后高糖（25mmol/L）培养骨髓EPCs CSAPASE-12、CASPASE-3蛋白表达改变结果1.大鼠骨髓内皮祖细胞的培养、鉴定早期贴壁细胞呈毛发样生长,多为骨髓基质细胞。二次贴壁的细胞大多在3天左右伸展成梭形或纺锤形。7～10天增殖速度加快可见内皮细胞特异性条索状结构。2周左右细胞可达80～90%融合,大部分细胞呈多角形,可呈铺路石样排列。80%以上细胞可同时吸收DiI-ac-LDL结合FITC-UEA-1即鉴定为内皮祖细胞。2.高糖对骨髓EPCs凋亡的影响不同浓度糖（5mmol/L、12.5mmol/L及25mmol/L）孵育EPCs 24h,结果显示高糖呈浓度依赖性诱导EPCs凋亡（7.34±0.44%,11.59±1.22%,36.82±2.16%）,与正常对照组（6.18±0.33%）比较差异均有统计学意义（P＜0.05）,其中以糖浓度为25mmol/L时凋亡率最高。高渗对照25mmol/L甘露醇组凋亡率与对照组比较无显著性差异（5.95±0.81%vs.6.18±0.33%,P＞0.05）。3.高糖激活骨髓EPCs内质网应激不同浓度糖（5mmol/L、12.5mmol/L及25mmol/L）孵育EPCs 24h,westernblot法测定GRP78表达,结果显示高糖激活内质网应激特异蛋白GRP78表达,并呈浓度依赖性（127.33±9.71,152.33±7.09,183.33±4.51）,与正常对照组（39±6.56）比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。4.高糖对CASPASE-12和CASPASE-3蛋白表达的影响不同浓度（5mmol/L、12.5mmol/L及25mmol/L）孵育EPCs 24h,western blot法测定CASPASE-12和CASPASE-3蛋白水平表达,结果显示高糖激活CASPASE-12和CASPASE-3,并呈浓度依赖性（cleaved-CASPASE-12:34.67±9.07,71.33±4.16,125.33±11.68;cleaved-CASPASE-3:64.67±7.37,131.67±9.02,165.33±5.69）,与正常对照组比较差异有统计学意义（cleaved-CASPASE-12;cleaved-CASPASE-3均无表达,P＜0.01）。5.CASPASE-12抑制剂（Z-ATAD-FMK）对高糖诱导的骨髓EPCs凋亡的影响25mmol/L高糖培养组予5uM Z-ATAD-FMK预处理后,与未预处理组比较高糖诱导的凋亡率明显下降（17.91±0.94%vs.36.82±2.16%,P＜0.05）,而对照组应用Z-ATAD-FMK预处理与未预处理组凋亡率无明显差异（5.62±0.92%vs.6.18±0.33%,P＞0.05）;6.CASPASE-12抑制剂（Z-ATAD-FMK）对高糖诱导的骨髓EPCs CASPASE-12和CASPASE-3蛋白表达的影响与未加抑制剂预处理组比较高糖加预处理组CASPASE-12和CASPASE-3活性均被明显抑制（cleaved-CASPASE-12:0 vs.58±7.21,P＜0.01;cleaved-CASPASE-3:155±10.58 vs.185.33±12.01,P＜0.05）。对照组预处理组与未预处理组cleaved-CASPASE-12、cleaved-CASPASE-3均无表达)。结论1)高糖培养可以浓度依赖性诱导大鼠骨髓EPCs凋亡。2)高糖可以激活大鼠骨髓EPCs内质网应激。3)CASPASE-12介导的内质网应激途径可能在高糖诱导的大鼠骨髓EPCs凋亡过程中发挥重要作用。研究背景2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）的发病率逐年升高,已成为威胁人类健康的常见疾病,糖尿病是冠心病的独立危险因素之一,近年来更加认为糖尿病是冠心病的等危症。T2DM常伴有多种心血管疾病的危险因素,易合并以动脉粥样硬化和血栓形成为特征的大血管病变,冠心病是引起T2DM患者死亡的主要原因,其中最为严重的是急性冠状动脉综合征（acute coronary syndroms,ACS）。近年的研究显示,动脉粥样硬化斑块破裂和血栓形成是ACS的主要发病机制,而斑块不稳定性是这些环节中的始动因素。急性冠脉综合征的发生与否取决于斑块的稳定程度,因此易损斑块的临床识别以及探索稳定斑块的方法具有十分重要的临床意义。由于存在血管重构,冠脉造影（coronary angiography,CAG）并不能真实地反映出冠脉病变程度—常低估冠脉病变。血管内超声（Intravascularultrosound,IVUS）能提供管腔、管壁横截面图像,能够分辨出斑块的大小、组成成分、分布以及观察斑块处血管的重构情况,在斑块稳定性、靶病变严重程度的评估等方面具有冠脉造影无法比拟的优势。内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是一类能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞。对于调节内皮细胞凋亡/再生平衡及保持内皮层的完整性有着重要作用。另外EPCs还参与新生血管的生成,这对于缺血组织侧枝循环的形成至关重要。因此,EPCs在糖尿病冠脉病变的发生发展中有重要的作用。冠脉造影研究显示与不伴有糖尿病的冠心病患者相比糖尿病患者冠状动脉病变严重,病变范围广并且冠状动脉侧支血管形成能力明显下降,应用血管内超声评价糖尿病对冠脉病变影响的研究尚少见报道;以往研究表明糖尿病患者循环EPCs数量和功能均受影响,但此种改变与急性冠脉综合征靶病变斑块稳定性及病变程度有何关系尚不明了。由此构成本课题的设计思路和研究目的。本课题应用血管内超声技术分析急性冠脉综合征患者靶病变严重程度、斑块负荷与外周血EPCs数量的关系,研究糖尿病合并ACS时对外周血EPCs数量的影响以及与易损斑块特征的关系。目的1.应用血管内超声方法研究糖尿病合并急性冠脉综合征患者靶病变斑块特征。2.观察糖尿病合并急性冠脉综合征患者循环内皮祖细胞数量变化。3.研究糖尿病合并急性冠脉综合征患者循环内皮祖细胞数量变化与靶病变严重程度和斑块负荷有无相关性。方法1.研究对象选自2007年7月至2008年1月间在我院接受冠状动脉造影（CAG）检查确诊为急性冠脉综合征（ACS）40例患者。包括急性心肌梗死（AMI）16例和不稳定型心绞痛（UAP）24例。AMI的临床诊断为伴有心肌坏死的血清心肌标志物浓度的动态演变的持续性静息状态胸痛的临床病史。靶血管病变经心电图、CAG和超声心动室壁运动资料确定。根据是否患有糖尿病将患者分为两组:糖尿病组（n=20）,非糖尿病组（n=20）。糖尿病诊断标准符合2005年ADA修订的诊断及分型标准,均为2型糖尿病。入院时收集患者的病史包括冠心病高危因素如高血压、高脂血症、吸烟史等临床资料。2.检查方法2.1冠状动脉造影检查所有患者按常规进行CAG检查,冠脉造影诊断标准按照美国Coronary Artery Surgery Study（CASS）研究:冠状动脉左主干狭窄≥50%,左前降支、左旋支及右冠状动脉狭窄≥70%为阳性。2.2血管内超声检查在常规冠状动脉血管造影结束后,采用标准的冠状动脉内介入导管操作技术进行IVUS检查,追加3000IU肝素,然后把0.014英寸的导丝送至靶血管,常规冠脉内注入200μg硝酸甘油。将IVUS导管沿导引钢丝越过靶病变,至靶病变远端1cm以上,利用自动回撤仪以0.5mm/s的速度自动匀速回撤至靶血管开口,所有获取的IVUS图像实时连续采集并存入硬盘,供以后脱机分析。2.3 IVUS图像的定量测量斑块形态由二位研究者采用盲法分别进行分析和处理。2.3.1 EEM-CSA:即血管外弹力膜的横断面积,手工描记外膜内边缘,由仪器自身的测量系统测得的。2.3.2 L-CSA（lumen-CSA）:是指血管腔的横断面积,手工描记内膜的内边缘,由仪器自身的测量系统测得的。当斑块包绕探头时,推测管腔的大小等于探头的大小。2.3.3 P-CSA（plaque-CSA）:经由外弹力膜面积减去血管管腔面积计算获得。2.3.4 PB（plaque burden）:即斑块负荷,为斑块面积除以外弹力膜面积乘以100%,它不同于管腔狭窄率。2.4循环内皮祖细胞培养、鉴定、计数2.4.1内皮祖细胞培养无菌采集外周血20mL,肝素抗凝,用PBS液等倍稀释血液。将稀释血液按1:2的比例置于人淋巴细胞分层液（LTS-1077）上以2 000 rpm离心30min。分离出单个核细胞后用5倍体积的PBS洗涤2次计数,调整细胞浓度以1×106/mL接种在包被0.1%明胶的24孔培养板。选择性M199培养基（含20%胎牛血清,青霉素100U/mL,链霉素100μg/mL,人血管内皮生长因子（VEGF）40 ng/mL,人成纤维细胞生长因子（FGF）2 ng/mL,人表皮生长因子（EGF）10 ng/mL,10U/mL肝素）诱导培养,4d后换液,继续培养至7d,PBS洗掉未贴壁细胞,贴壁细胞进行细胞鉴定。2.4.2内皮祖细胞鉴定内皮祖细胞可结合FITC标记的植物凝集素（FITC-UEA-1）并且能吸收DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-ac-LDL）,能结合两者的细胞可鉴定为内皮祖细胞。首先在37℃细胞与DiI-ac-LDL（2.4μg/ml）共同孵育1小时,然后用2%多聚甲醛固定10分钟,轻轻冲洗后与FITC-UEA-1（10μg/mL）共同孵育1小时,PBS冲洗后在倒置荧光显微镜下观察,双染阳性者为内皮祖细胞。2.4.3内皮祖细胞计数由两位研究者采用盲法分别计数双染细胞,每孔随机选取3个高倍镜视野计数,取平均值。结果靶病变分布情况:左前降支22例（55%）,左回旋支8例（20%）,右冠10例（25%）。血管内超声结果血管内超声分析示,糖尿病组管腔面积,外弹力膜面积,斑块面积和斑块负荷分别为3.3±1.6,14.3±3.0 and 11.1±2.7 mm2,76.5%±11.7%;非糖尿病组管腔面积,外弹力膜面积,斑块面积和斑块负荷分别为4.9±2.2,13.8±3.4 and 9.0±2.6mm2,66.2%±13.2%。与非糖尿病组比较糖尿病组斑块负荷明显增大。循环内皮祖细胞计数糖尿病组循环内皮祖细胞数量明显低于非糖尿病组（30.4±6.99 vs.51.7±11.1EPCs/×200 field,P＜0.05）。循环内皮祖细胞数量与斑块负荷的相关性糖尿病组循环内皮祖细胞数量与斑块负荷呈负相关（r=-0.427,P＜0.05）。结论1.糖尿病组病变部位的斑块面积和斑块负荷均大于非糖尿病组,管腔面积小于非糖尿病组;2.糖尿病组患者循环内皮祖细胞数量明显低于非糖尿病组;3.糖尿病组患者斑块负荷、靶病变严重程度与循环内皮祖细胞数量负相关,提示靶病变严重程度与循环内皮祖细胞数量相关;4.糖尿病急性冠脉综合征患者冠脉病变程度严重可能与内皮祖细胞减少导致的斑块迅速增长及血管内皮的再内皮化降低有关。
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