籼稻成熟胚愈伤组织诱导及再生体系的优化

论文摘要

水稻是世界上最重要的粮食作物,同时也是单子叶植物基因组学和功能组学研究的模式作物。遗传转化在水稻品种改良、基因功能检测、抗逆研究中发挥越来越重要的作用,已成为开展水稻基因组学和功能组学研究的一种有效手段。水稻的遗传转化中最常用的方法是农杆菌介导法,与其他转化方法相比,农杆菌是天然的转化载体,转化具有独特的优势。但是,由于水稻品种间遗传特异性及基因依赖性差别,导致了水稻遗传转化的复杂性。籼稻和粳稻是栽培稻的两个主要亚种,它们的组织培养特性差异大,籼稻较粳稻的再生频率低,转基因植株的获得需要通过大量的重复实验。目前还没有适用于所有籼稻品种的高效遗传转化体系。但籼稻是我国的主要栽培稻,遗传转化技术的成熟对籼稻进行改良具有重要意义。红莲型细胞质雄性不育（HL-CMS）水稻是生产上应用的三大主要的细胞质雄性不育栽培稻（Oryza sativa L）类型之一。本研究结合本实验室在水稻遗传转化方面的工作,探讨以HL- CMS籼稻不育系粤泰A与保持系粤泰B成熟胚为材料的愈伤组织诱导及再生体系优化。主要的研究结果如下。1、分析了影响籼稻品种YTA与YTB成熟胚愈伤组织诱导及继代的主要因素。发现较大高低温差处理有利于水稻种子的去休眠和提高水稻愈伤组织的诱导率。种子的消毒灭菌只采用浓度为1.5%次氯酸钠溶液,较其它方法更能提高愈伤组织的诱导率。2,4-D的浓度在3mg·L-1左右诱导率高,在此条件下,添加一定浓度的6-BA对诱导效果影响不大。培养基中添加100-500 mg·L-1的硫代硫酸钠及30 mg·L-1腐胺等小分子有机物能改善愈伤组织的质量,降低褐化率。不同培养基对YTA和YTB的愈伤诱导率及继代生长状况有很大的影响,N6、NB、MS三种培养基均可用于YTA和YTB愈伤组织的诱导和继代,诱导16天后,再继代6天,愈伤组织的胚性状态最好。2、分析了影响农杆菌转化及分化成苗的主要因素。发现抗性愈伤率与抗性愈伤组织质量是一对矛盾。一定的真空负压处理及适当的干燥处理能够提高转化率。V型筛选可以使转基因植株的阳性率有所提高。针对在分化过程中抗性愈伤组织出绿但成苗率低的问题,采用第一次分化用MS培养基,第二次分化用1/2MS培养基的方法进行分化的方法,大大提高了成苗率,成苗率可达100%。3、通过石蜡切片观察不同状态下YTB成熟胚愈伤组织内部结构的微观变化,显示了形态观察和解剖观察结果的一致性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物组织培养的定义及概况
• 1.2 影响水稻愈伤组织诱导和培养的主要因素
• 1.2.1 外植体的选择及预处理
• 1.2.1.1 外植体的选择
• 1.2.1.2 成熟种子的预处理
• 1.2.2 基因型
• 1.2.3 培养基的基本成分
• 1.2.4 培养条件
• 1.2.5 植物激素（内、外源激素）
• 1.2.6 继代培养
• 1.3 植物的遗传转化研究
• 1.3.1 植物遗传转化的主要方法
• 1.3.2 根瘤农杆菌介导的植物遗传转化研究
• 1.3.2.1 根瘤农杆菌Ti 质粒的工作过程与作用机理
• 1.3.2.2 根瘤农杆菌介导的植物转基因法的优势
• 1.3.2.3 影响根瘤农杆菌介导的植物遗传转化的主要因素
• 1.4 抗性愈伤组织的分化、生根和移栽
• 1.4.1 分化的影响因素
• 1.4.2 生根和移栽
• 1.5 籼稻遗传转化体系中存在的问题
• 1.5.1 褐变
• 1.5.2 污染
• 1.5.3 过度含水化
• 1.5.4 培养周期长
• 1.6 本研究课题的目的和意义
• 第二章 籼稻YTA 与YTB 成熟胚愈伤组织诱导及继代培养条件的优化
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料、仪器、试剂、方法及实验设计
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验仪器
• 2.2.3 实验试剂
• 2.2.4 实验方法
• 2.2.4.1 基本培养基及其成分
• 2.2.4.2 培养基的准备
• 2.2.4.3 胚性愈伤组织的诱导
• 2.2.4.4 胚性愈伤组织的继代
• 2.2.5 实验设计
• 2.2.5.1 成熟种子的预处理温度试验设计
• 2.2.5.2 成熟种子不同消毒灭菌方法的试验设计
• 2.2.5.3 愈伤组织诱导培养条件试验设计
• 2.2.5.4 愈伤组织诱导培养基的选择试验
• 2.2.5.5 愈伤组织继代培养基的选择试验
• 2.3 实验结果与分析
• 2.3.1 不同处理温度对籼诱导率的影响
• 2.3.2 不同消毒灭菌方法对诱导率的影响
• 2.3.3 培养条件对诱导效果的影响
• 2.3.3.1 温度、光照
• 2.3.3.3 2,4-D 浓度
• 2.3.3.4 6-BA 浓度
• 2.3.3.5 活性炭、抗坏血酸、硫代硫酸钠
• 2.3.3.6 小分子有机附加物
• 2.3.3.7 多胺
• 2.3.3.8 Fe 元素
• 2.3.4 不同基本培养基对诱导及生长的影响
• 2.3.5 不同基本培养基对继代生长的影响
• 2.5 结论
• 第三章 农杆菌介导籼稻YTA 与YTB 成熟胚愈伤组织的遗传转化条件的优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 实验仪器
• 3.2.3 实验试剂
• 3.2.4 实验方法
• 3.2.4.1 基本培养基及其成分
• 3.2.4.2 培养基的准备
• 3.2.4.3 农杆菌的侵染与抗性愈伤的筛选
• 3.2.4.4 转基因植株的再生
• 3.2.5 实验设计
• 3.2.5.1 农杆菌遗传转化影响因素的实验设计
• 3.2.5.2 抗性愈伤组织分化再生的试验设计
• 3.2.5.3 转基因植株生根培养的试验设计
• 3.2.5.4 不同条件下YTB 胚性愈伤组织内部结构变化的试验设计
• 3.3 实验结果及分析
• 3.3.1 农杆菌不同培养方式
• 3.3.2 农杆菌不同菌液浓度
• 3.3.3 农杆菌不同侵染方法
• 3.3.4 共培养方式
• 3.3.5 干燥处理方法对对水稻转化效率的影响
• 3.3.6 不同潮霉素浓度
• 3.3.7 不同生长素浓度
• 3.3.8 不同 6-BA 浓度
• 3.3.9 不同基本培养基对抗性愈伤组织分化效果的影响
• 3.3.10 不同生长素浓度对YTA 与YTB 转基因植株生根的影响
• 3.3.11 胚性愈伤组织的细胞学观察
• 3.3.11.1 YTB 诱导培养基中添加多胺
• 3.3.11.2 YTB 愈伤组织不同诱导及继代时间
• 3.3.11.3 YTB 和日本晴愈伤组织侵染过程中真空负压处理
• 3.3.11.4 YTB 筛选培养后的抗性愈伤组织在不同分化培养基上培养
• 3.3.11.5 YTB 愈伤组织分化过程中出绿与不出绿愈伤组织
• 3.4 结论
• 3.4.1 农杆菌介导的籼稻YTA、YTB 成熟胚愈伤组织遗传转化转化体系的优化
• 3.4.2 胚性愈伤组织的细胞学观察
• 参考文献
• 附录一：常用激素及抗生素的配制
• 附录二：常用培养基成分及石蜡切片观察的方法
• 致谢
• 在读期间发表的论文