论文题目: Aspergillus versicolor D-1及其选择性催化的还原反应
论文类型: 博士论文
论文专业: 微生物与生化药学
作者: 关宏
导师: 游松
关键词: 生物转化,选择性,不对称还原反应,碳碳双键,不饱和内酯
文献来源: 沈阳药科大学
发表年度: 2005
论文摘要: 生物催化的高效性、选择性、安全性以及环境友好等优点，使其在一些化学合成领域，特别是在对映体纯的手性化合物的合成和消旋体拆分等方面，具有化学催化不可比拟的优势。生物催化的还原反应能使分子内的羰基或碳-碳双键立体选择性的还原，将潜手性底物转化为手性产物，在不对称合成中有着重要的作用。 本文通过二步发酵法，采用TLC分析方法，考察了11株供试真菌对左旋一叶萩碱的转化能力，发现分离株Aspergillus sp．D-1能够完全转化左旋一叶萩碱，产生一种转化产物。经制备规模转化、硅胶柱层析分离和UV、IR、MS、1H，13C-NMR等光谱学鉴定，确定转化产物为14，15-二氢一叶萩碱。从而证明了Aspergillus sp．D-1能够催化左旋一叶萩碱的不饱和内酯共轭体系中γ，δ-碳碳双键的还原反应。 利用传统形态学和分子生物学等分类方法对Aspergillus sp．D-1进行分类鉴定。根据其形态学特征，将Aspergillus sp．D-1归属在曲霉属巢状亚属杂色组。采用真菌核糖体基因内转录间隔区（ITS）序列作为分子标记，利用DNAMAN 5.2.2和Mega 3.0等软件对其进行同源性和进化关系分析，在种的水平上将Aspergillus sp．D-1归属为Aspergillus versicolor，并将该菌株命名为A．versicolor D-1。首次发现A．versicolor具有还原不饱和内酯共轭体系中γ，δ-碳碳双键的能力。 通过单因素实验，采用二步发酵法和HPLC分析方法，考察了初始pH、温度和底物浓度对A．versicolor D-1静息细胞还原左旋一叶萩碱的影响。结果表明，Aspergillus versicolor D-1静息细胞在初始pH值为7.0、温度为28℃、底物浓度为146.7 mg／L的条件下反应8 h，A．versicolor D-1静息细胞的活性最大，单位重量的菌丝体的最大转化量为486.7 mg／L／g（干细胞），转化率在98％以上。通过继续延长转化时间，检测发酵液中14，15-二氢一叶萩碱的浓度恒定，从而证明了A．versicolor D-1转化左旋一叶萩碱具有选择性。首次在真菌中发现这种选择性催化异型生物质不饱和内酯共轭体系中γ，δ-碳碳双键的还原反应。 采用HPLC分析方法，通过跟踪检测左旋一叶萩碱还原酶的活性，发现左旋一叶萩碱还原酶是一种存在于胞浆中的可溶性蛋白。考察左旋一叶萩碱在转化体系中存在与否对A．versicolor D-1产生左旋一叶萩碱还原酶的影响，发现左旋一叶萩碱还原酶是诱导酶，左旋一叶萩碱既是底物，又是诱导物。通过检测不同辅因子存在的条件下左旋一叶
论文目录:
摘要
ABSTRACT
缩略语说明
第一章 绪论
1.1 生物催化和不对称合成
1.2 生物还原反应和不对称还原
1.3 新型生物还原剂的开发
1.4 核糖体rDNA ITS序列在真菌分类鉴定中的应用
1.5 研究目的和技术路线
第二章 还原左旋一叶蔌碱的微生物筛选
2.1 实验材料
2.2 实验方法
2.3 实验结果
2.3.1 菌株筛选实验
2.3.2 转化产物的结构鉴定
2.4 讨论
第三章 A.versicolor D-1的鉴定
3.1 实验材料
3.2 实验方法
3.3 实验结果
3.3.1 菌落形态
3.3.2 菌丝体个体形态
3.3.3 分生孢子的表面文饰
3.3.4 PCR扩增产物
3.3.5 ITS-5.8S片断的测序结果
3.3.6 ITS-5.8S序列比对
3.3.7 ITS-5.8S序列的进化分析
3.4 讨论
第四章 A.versicolor D-1静息细胞转化左旋一叶蔌碱条件的优化
4.1 实验材料
4.2 实验方法
4.3 实验结果
4.3.1 生长细胞和静息细胞催化还原左旋一叶蔌碱的比较
4.3.2 初始pH值对静息细胞转化的影响
4.3.3 温度对静息细胞转化的影响
4.3.4 左旋一叶蔌碱浓度对静息细胞转化的影响
4.3.5 静息细胞预培养的时间对其转化的影响
4.3.6 静息细胞转化左旋一叶蔌碱的动态曲线
4.4 讨论
第五章 A.versicolor D-1的一叶蔌碱还原酶性质的研究
5.1 实验材料
5.2 实验方法
5.3 实验结果
5.3.1 左旋一叶蔌碱还原酶的亚细胞定位
5.3.2 左旋一叶蔌碱还原酶的诱导合成
5.3.3 左旋一叶蔌碱还原酶的辅因子
5.3.4 酶法制备的转化产物的鉴定
5.3.5 左旋一叶蔌碱还原酶的最适反应温度
5.3.6 左旋一叶蔌碱还原酶的最适反应pH值
5.3.7 左旋一叶蔌碱还原酶的温度稳定性
5.4 讨论
第六章 A.versicolor D-1催化3-羟基-1(10),3,11(13)-愈创木三烯-12,6-内酯-2-酮的不对称还原反应
6.1 实验材料
6.2 实验方法
6.3 实验结果
6.3.1 HGT的结构确证
6.3.2 A.versicolor D-1对不同化合物转化能力的考察
6.3.3 HGD1的结构鉴定
6.3.4 生长细胞和静息细胞转化HGT的比较
6.3.5 HGD2的结构鉴定
6.3.6 生长细胞转化HGT的动态曲线
6.4 讨论
结论
参考文献
致谢
附图
攻读博士学位期间发表的学术论文
发布时间: 2006-11-27
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