RNA干扰技术对花花柴液泡膜Na+/H+反向运输载体NHX基因功能的鉴定

论文摘要

高浓度的Na+离子将对植物产生危害,而植物液泡型Na+/H+逆向运输体可利用液泡膜H+-ATPase（V-ATPase）和H+-PPase（V-PPase）产生的跨膜质子电化学梯度将液泡基质中质子顺电化学梯度运出液泡,同时将胞质中的Na+逆浓度梯度运入液泡内,这使得植物不仅能降低胞质内的Na+以维持胞质正常的K+/N+比值,还可有效利用储存在液泡中的Na+作为渗透剂,增加细胞的保水能力,从而提高植物的耐盐性。RNA干涉（RNA interference,RNAi）是指由短双链RNA诱导的同源RNA降解,从而导致靶基因的表达沉默,产生相应的功能表现型缺失的现象。目前RNA干扰技术已广泛应用于植物生物工程,它不仅是一种发现或验证基因功能的有效工具,还是快速降低目的基因表达的手段。因此,RNA干扰技术已广泛应用于沉默基因表达的研究。花花柴（Karelinia caspica）又名胖姑娘,属菊科花花柴属多年生草本植物。在草甸盐土,盐化草甸土和盐碱化弃耕地上生长,属于泌盐生植物。本实验室在前期的研究中已成功地建立了花花柴组织培养体系,克隆获得了花花柴液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因KcNHX1,KcNHX2的cDNA序列（DQ303231,DQ304690）。但两者的同源性较低,仅为64.91%,两者属于NHX基因家族的不同成员,在植物体内可能行使不同的生理功能。为了研究KcNHX1与KcNHX2是否为花花柴盐胁迫的主效基因,本实验室采用RNAi技术,选择KcNHX1或KcNHX2的部分基因编码区,与KcNHX2基因中的长度为120 bp的第一内含子作为介导正反义链形成发卡结构的区段,成功构建了干扰KcNHX1或KcNHX2表达的RNAi载体。本研究在此基础上,将花花柴NHX1和NHX2的RNAi载体导入花花柴中,经潮霉素抗性筛选获得抗性苗,提取其基因组进行PCR鉴定初步表明KcNHX1,KcNHX2 RNAi元件已整合到花花柴基因组中,得到6棵转pCAMBIAl301-1.1-KcNHX1i基因的植株,8棵转pCAMBIA1301-1.1-KcNHX2i基因的植株,并对转基因植株进行了RT-PCR检测及耐盐分析。结果表明,得到的6棵转花花柴VHX1干涉载体阳性植株中有4株植株体内的NHX1基因表达完全被抑制;而8棵转花花柴VHX2干涉载体阳性植株中有4株植株体内的NHX2基因的表达被抑制。耐盐分析表明RNAi技术对基因表达沉默是有效的。KcNHX1基因表达抑制的植株在盐胁迫下丙二醛、相对电导率上升幅度,叶绿素下降幅度比野生型大,差异极显著。植株抗氧化性比非转基因植株差,这些结果初步说明KcNHX1基因在花花柴耐盐功能中发挥重要作用,可能是花花柴耐盐的主效基因之一。但KcNHX2基因表达抑制的植株在盐胁迫下丙二醛、相对电导率、叶绿素等指标测定与野生型花花柴相比未呈现规律性变化,植株耐盐性没有受到影响,其具体功能还有待进一步深入研究。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略语
• 第一部分 文献综述
• 第一章 RNA干扰（RNAi）技术及其在植物中的应用研究进展
• 1 RNAi技术的发现
• 2 RNAi技术发生的机制
• 3 RNAi作用过程中的相关的酶和蛋白
• 4 RNAi的特征
• 5 RNAi技术在植物中的应用
• +/H⁺逆向转运蛋白与耐盐相关性'>第二章 植物Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与耐盐相关性
• +/H⁺逆向转运蛋白的发现'>1 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的发现
• +/H⁺逆向转运蛋白基因的克隆'>2 植物液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因的克隆
• +/H⁺逆向运转体的结构特征'>3 液泡膜Na⁺/H⁺逆向运转体的结构特征
• +/H⁺逆向转运蛋白的功能'>4 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白的功能
• +/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性'>5 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性
• 第三章 本研究的目的与意义
• 参考文献
• 第二部分 实验部分
• +/H⁺反向运输载体NHX1基因的RNA干涉对植株耐盐性的影响'>第一章 花花柴液泡膜Na⁺/H⁺反向运输载体NHX1基因的RNA干涉对植株耐盐性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌的转化
• 1.2.2 根癌农杆菌介导叶盘法转化花花柴及植株再生
• 1.2.3 植物基因组DNA的提取
• 1.2.4 转基因花花柴的PCR鉴定
• 1.2.5 转基因阳性植株RNA提取
• 1.2.6 转基因阳性植株DNaseI消化总RNA
• 1.2.7 半定量PCR检测
• 1.2.8 野生型花花柴耐盐浓度的探索
• 1.2.9 MDA含量测定
• 1.2.10 相对电导率测定
• 1.2.11 叶绿素含量测定
• 1.2.12 根长测定
• 1.2.13 转基因花花柴叶片组织耐盐性试验
• 1.2.14 转基因花花柴叶片组织抗氧化试验
• 2 结果与分析
• 2.1 植物RNAi载体转化农杆菌鉴定
• 2.2 潮霉素浓度对花花柴叶片不定芽再生的影响
• 2.3 菌液浓度及浸染时间的确定
• 2.4 转基因花花柴的获得
• 2.5 植物基因组DNA提取及抗性苗的初步鉴定
• 2.6 花花柴阳性植株RNA提取及DNaseI消化
• 2.7 半定量PCR检测
• 2.8 花花柴耐盐浓度临界值探索
• 2.9 MDA含量测定
• 2.10 转基因植株相对电导率测定
• 2.11 转基因植株叶绿素测定
• 2.12 根长的测定
• 2.13 叶片组织抗氧化试验
• 3 讨论
• 3.1 影响花花柴的遗传转化体系的因素
• 3.2 KcNHX1基因是花花柴耐盐过程中的主效基因之一
• 参考文献
• +/H⁺反向运输载体NHX2基因的RNA干涉对植株耐盐性的影响'>第二章 花花柴液泡膜Na⁺/H⁺反向运输载体NHX2基因的RNA干涉对植株耐盐性的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 农杆菌的转化[参考第一章1.2.1]
• 1.2.2 转基因花花柴的PCR鉴定
• 1.2.3 转基因阳性植株的RNA提取[参考第一章1.2.5]
• 1.2.4 转基因阳性植株DNaseI消化总RNA[参考第一章1.2.6]
• 1.2.5 转基因阳性植株的半定量PCR检测
• 1.2.6 转KcNHX2i植株盐处理
• 2 结果与分析
• 2.1 植物RNAi载体转化农杆菌鉴定
• 2.2 植物基因组DNA的提取及抗性苗的初步鉴定
• 2.3 花花柴阳性植株RNA提取及DNaseI消化
• 2.4 转基因植株的半定量PCR检测
• 2.5 盐胁迫下植株MDA含量测定
• 2.6 瓶中盐胁迫下植物叶绿素测定
• 2.7 盐处理下KcNHX1与KcNHX2的表达差异
• 3 讨论
• 参考文献
• 结论
• 展望
• 个人简历
• 致谢