外源木聚糖酶在枯草芽孢杆菌中信号肽筛选

论文摘要

木聚糖酶是一类能将木聚糖降解成低聚木糖或木糖的复合水解酶系,其中β-1,4-D-木聚糖酶负责水解木聚糖主链骨架,是酶系中的关键酶。这种酶在提高饲料转化率、发酵成产乙醇、纸浆漂白等众多领域有着十分重要的应用价值,然而酶活力低使生产成本提高成为了限制其工业化生产的主要问题。枯草芽孢杆菌是近年来研究较多的表达系统,其具有遗传背景清晰,易操作,无致病性,可以直接分泌胞外蛋白等优势。外源蛋白在该表达系统中分泌必须依赖于枯草杆菌自身信号肽的引导,现已发现的枯草杆菌信号肽约有170个,且有研究表明信号肽和外源蛋白间存在适配性问题,因此针对目标蛋白建立一套信号肽筛选系统是提高外源蛋白分泌的有效途径。本研究首先构建木聚糖酶信号肽筛选载体,选用前期获得的来源于短小芽孢杆菌（BYG5-20N）的耐碱性木聚糖酶基因为目标蛋白,以含壮观霉素抗性基因的大肠杆菌—枯草杆菌穿梭载体pGJ18为基本骨架,木聚糖酶基因可在麦芽糖诱导型启动子PglvM诱导表达。最后在信号肽位点处连入一段绿色荧光蛋白基因,以便于信号肽片段的插入。然后从枯草芽孢杆菌A1747基因组中扩增获得24个Sec途径信号肽,将其逐个连接至筛选载体上,从而构建一系列分泌表达载体,并在枯草芽孢杆菌WB700中实现表达分泌。重组菌在3%麦芽糖的LB培养基中培养24h,之后采用DNS法测定上清液中木聚糖酶活力。试验结果显示不同信号肽引导木聚糖酶分泌能力有着显著差异,其中其中YnfF信号肽引导分泌能力最强,其上清酶活为37.2U/mL。此外,我们采用目标蛋白与绿色荧光蛋白融合的方法,希望能通过荧光标记在亚细胞条件下找到影响蛋白分泌的瓶颈,进而分析不同信号肽引导分泌能力差异的原因。利用重叠PCR的方法将去掉终止子的木聚糖酶基因（XynA）与绿色荧光蛋白（GFP）基因融合,选择将前期筛选到的分泌量较高的YnfF和分泌量较低的AmyE信号肽连接该载体上,3%麦芽糖诱导表达24小时后,测定上清酶活,并用荧光倒置显微镜观察菌液。结果显示,这两个重组枯草杆菌培养液上清中扣除WB700本底酶活后,并未检测到木聚糖酶酶活,但是观察菌液却均能看见明显荧光,且在相同曝光条件下荧光亮度相当。试验证明对在枯草杆菌中对外源蛋白进行信号肽筛选是提高其分泌的有效途径,并获得了针对木聚糖酶高效分泌信号肽YnfF。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 木聚糖酶
• 1.1.1 木聚糖酶的分类
• 1.1.2 木聚糖酶的结构
• 1.1.3 木聚糖酶的特征
• 1.1.4 木聚糖酶的应用
• 1.1.5 木聚糖酶基因的克隆与表达
• 1.2 枯草芽孢杆菌表达系统
• 1.2.1 枯草芽孢杆菌表达系统优势及不足
• 1.2.2 枯草杆菌基因表达的一般特点
• 1.2.3 载体
• 1.3 枯草芽孢杆菌分泌途径及机理
• 1.3.1 枯草芽孢杆菌分泌相关元件
• 1.3.2 分泌途径
• 1.3.3 影响外源蛋白在枯草芽孢杆菌中分泌表达的因素
• 1.3.4 提高外源蛋白在在芽孢杆菌中分泌表达途径
• 1.4 研究简介
• 第二章 试验研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 信号肽筛选载体构建
• 2.2.2 信号肽片段克隆及分泌表达载体的构建
• 2.2.3 木聚糖酶基因表达
• 2.2.4 不同信号肽对重组枯草芽孢杆菌分泌木聚糖酶影响
• 2.2.5 信号肽的SignalP3.0 分析
• 2.2.6 木聚糖酶和GFP 融合蛋白载体构建
• 2.3 讨论
• 2.4 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 个人简介