小麦成熟胚脱分化的组织定位及细胞壁相关基因表达研究

论文摘要

本研究以豫麦18为材料,从外部形态、细胞结构及基因表达等不同层面对小麦成熟胚脱分化进行了研究,以期揭示小麦成熟胚脱分化的组织定位和分子机理。主要研究结果如下:本文应用显微技术,观察了小麦成熟胚脱分化过程中细胞的形态变化,并对脱分化的起始部位进行初步定位。结果表明,小麦成熟胚脱分化首先发生于胚根鞘细胞,这些细胞在2,4-D诱导条件下,培养6h启动脱分化,逐步回复变化为薄壁细胞,至24h便有愈伤组织形成,培养72h,小麦成熟胚已经脱分化形成体积较大的愈伤组织团,这些愈伤组织主要由胚根鞘细胞脱分化而来的薄壁细胞组成。其主要表现为,细胞间隙增大,体积逐渐变大,细胞中液泡明显,细胞核变大,被大液泡排挤到细胞边缘。经透射电镜观察表明,小麦成熟胚脱分化过程中细胞壁变薄,细胞器种类增多,线粒体、内质网等细胞器数量增加,淀粉粒、脂体等物质密度减小至消失,随着原有物质的消失和新物质出现,细胞质重新组合。为研究小麦成熟胚脱分化分子机理,本研究利用Affymetrix wheat GeneChip?基因芯片技术在转录水平研究了细胞壁相关基因在小麦成熟胚脱分化过程中的表达变化。以小麦成熟胚脱分化起始0点为对照,分别研究0、2、6、12、24和72h时这些基因的表达变化,将那些与0点比值大于2或小于0.5,即表达变化两倍以上的基因视为有意义的基因,分析了这些发生有意义变化的细胞壁相关基因在小麦成熟胚脱分化中的表达情况。结果表明,在含有61127个探针组,代表了55085个基因的小麦基因组表达谱上,发生有意义表达变化的基因共约有15000个。其中,有138个细胞壁相关基因在小麦成熟胚细胞脱分化过程中至少在一个时间点中发生了有意变化,它们的表达产物按功能分为8类:分别是伸展蛋白、扩张蛋白、纤维素合成酶、纤维素酶、甘露糖磷酸变位酶、半乳糖激酶、肉桂酰-CoA还原酶、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶。分析表明,伸展蛋白基因45个,扩张蛋白基因48个,它们大多表达上调,推测这些基因对小麦成熟胚细胞脱分化过程中细胞壁的伸展起重要作用。其中,AY543542.1、CD490917、AY543544.1、BJ249762等扩张蛋白基因在0-72h主要为上调,且在24h或72h时上调倍数为200以上。CA640232、CA604159、CA641446等伸展蛋白基因在24h或72h也达到最大值,上调倍数30以上。细胞壁扩张蛋白和伸展蛋白基因在小麦成熟胚脱分化过程中的表达,与我们观察到的细胞壁变化是相对应的,也说明了细胞结构与功能的统一。与细胞壁物质代谢相关的基因45个,包括纤维素合成酶基因13个,纤维素酶基因2个,甘露糖磷酸变位酶基因3个,半乳糖激酶基因8个,肉桂酰-CoA还原酶基因16个,尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因3个。这些基因在小麦成熟胚培养的整个过程或某些时间点表现为上调表达,它们对小麦成熟胚细胞脱分化过程中细胞壁物质的合成和分解起到重要作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 细胞脱分化研究概况
• 1.1.1 植物组织培养概述
• 1.1.2 植物细胞脱分化过程中的生理活动与细胞结构变化
• 1.1.3 细胞脱分化调控机理
• 1.1.3.1 细胞周期调控
• 1.1.3.2 激素的作用
• 1.1.4.细胞分裂与愈伤组织形成
• 1.2 小麦愈伤组织诱导
• 1.2.1 小麦成熟胚离体培养
• 1.2.2 小麦成熟胚脱分化研究意义
• 1.3 芯片技术
• 1.3.1 基因芯片技术概述
• 1.3.2 基因芯片技术的应用
• 2 引言
• 3 技术路线
• 4 材料与方法
• 4.1 供试材料
• 4.2 试剂配制
• 4.2.1 Epon812 树脂的配制:
• 4.2.2 100mM 磷酸缓冲液（pH7.4）的配制:
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 显微观察
• 4.3.2 基因芯片实验方法
• 4.3.2.1 材料处理
• 4.3.2.2 RNA 的提取
• 4.3.2.3 RNA 的纯化
• 4.3.2.4 cDNA、cRNA 的合成与纯化
• 4.3.2.5 cRNA 片断化
• 4.3.2.6 芯片杂交
• 4.3.2.7 芯片检测参数的获取
• 4.3.2.8 差异表达基因的注解及分类
• 5 结果与分析
• 5.1 小麦成熟胚脱分化的组织定位和细胞结构变化
• 5.1.1 小麦成熟胚2，4-D 诱导与无2，4-D 诱导下表型观察分析
• 5.1.2 小麦成熟胚脱分化过程中细胞结构变化
• 5.1.3 小麦成熟胚脱分化初期细胞的超微结构观察
• 5.2 小麦成熟胚脱分化过程中细胞壁变化相关基因差异表达分析
• 5.2.1 小麦成熟胚脱分化过程中扩张蛋白基因差异表达分析
• 5.2.2 小麦成熟胚脱分化过程中伸展蛋白基因差异表达分析
• 5.2.3 小麦成熟胚脱分化过程中细胞壁代谢相关基因差异表达分析
• 5.2.3.1 纤维素合成酶基因表达分析
• 5.2.3.2 纤维素酶基因表达分析
• 5.2.3.3 甘露糖磷酸变位酶基因表达分析
• 5.2.3.4 半乳糖激酶基因表达分析
• 5.2.3.5 肉桂酰-CoA 还原酶基因表达分析
• 5.2.3.6 尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）基因表达分析
• 6 结果讨论
• 6.1 脱分化时期划分
• 6.2 脱分化过程中细胞结构变化
• 6.3 脱分化过程中细胞壁相关基因表达
• 参考文献
• ABSTRACT