甲基对硫磷降解菌的分离、鉴定及水解酶基因的克隆

论文摘要

利用微生物对有机磷农药的降解性能消除其在环境中的残留,是治理环境污染的一项有效手段。甲基对硫磷（methylparathion,以下简称MP）又称甲基1605,是一类目前广泛使用的高毒有机磷农药,其主要中间代谢产物为对硝基苯酚（ρ-nitrophenol,以下简称PNP）,易溶于水,具有中等毒性。由于二者都具有苯环结构,残留期很长,给人类健康造成潜在威胁。本文从华阳农药厂污水处理曝气池中分离,筛选到了多株能降解甲基对硫磷的菌株。其中菌株Yw12,Yw15,Yw18,Yw28具有较好的降解性能。Yw12能以甲基对硫磷为唯一碳源,磷源,对硝基苯酚为唯一碳源生长,经鉴定,为根癌农杆菌（ Agrobacterium.tumefaciens ）。Yw15,Yw18,Yw28,能以甲基对硫磷和对硝基苯酚为唯一碳源生长,经鉴定,为苍白杆菌（Ochrobacterum sp.）四株菌的16S rDNA序列在Genbank中的注册号分别为DQ468100,DQ468101, DQ468102和DQ468103。并对四株菌进行了系统发育分析。分别用气相色谱法和分光光度法对四株菌的降解性能进行了研究,结果表明四株菌在0.5小时内对50mg/L甲基对硫磷的降解率达90%以上;在8小时内能将50mg/L对硝基苯酚完全降解。四株菌也同时能够在以甲胺磷,辛硫磷,毒死蜱,克百威,溴氰菊酯,阿特拉津为唯一碳源的基础培养液中生长,表明四株菌具有广泛的农药降解谱。用多种方法提取四株野生型菌的质粒,只有用碱法大量提取时发现有比其基因组大的条带出现,根据国内外报道有的野生型菌株的质粒大于其基因组,推测Yw15,Yw18,Yw28三株菌中可能存在大质粒,但用紫外线,电穿孔,变温SDS等质粒消除的方法均没消除掉,可能条件有待于改进。以四株菌基因组为模板,用PCR法克隆其水解酶基因mpd。将克隆到的菌株Yw12 ,Yw15,Yw18,Yw28的mpd基因进行测序,其结构基因全长为998bp, 999bp,998bp,999bp。基因注册号分别为:DQ843605,DQ843606,DQ843607,DQ843608。测序结果在Genebank nucleic-nucleic Blast进行比对,发现它们与其它甲基对硫磷降解菌的mpd基因同源性高达99%,说明甲基对硫磷水解酶结构基因mpd具有非常高的保守性,四株菌的mpd基因可能是甲基对硫磷水解酶基因的同源基因。四株菌全细胞粗酶液SDS-PAGE电泳表明,其甲基对硫磷降解酶在菌体中呈组成型表达,且初步确定四株野生型菌株MPD水解酶属于胞内酶。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩略词
• 1 引言
• 1.1 农药及农药的危害
• 1.2 化学农药与环境污染
• 1.3 微生物降解有机磷农药的研究进展
• 1.3.1 降解有机磷农药微生物的多样性
• 1.3.2 有机磷农药降解菌的获得与鉴定
• 1.3.3 降解机理与代谢途径
• 1.3.4 影响农药降解的因素
• 1.3.5 有机磷农药水解酶基因的克隆
• 1.3.6 有机磷降解酶的研究
• 1.3.7 农药微生物降解的新技术和新方法
• 1.3.8 降解有机磷农药微生物的研究趋向
• 1.4 降解有机磷农药的微生物在本实验室的研究
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 药品与试剂
• 2.1.3 主要仪器及设备
• 2.1.4 培养基与试剂配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌株的分离与纯化
• 2.2.2 形态观察与生理生化实验
• 2.2.3 CTAB 法提取基因组DNA
• 2.2.4 16S rDNA 序列分析
• 2.2.5 基因注册与遗传学分析
• 2.2.6 四株菌对有机磷农药的降解性能测定
• 2.2.6.1 气相色谱法测定甲基对硫磷的降解
• 2.2.6.2 四株菌对甲基对硫磷的降解曲线
• 2.2.6.3 菌株接种量对降解性能的影响
• 2.2.6.4 pH 值对菌株降解性能的影响
• 2.2.6.5 温度对菌株降解性能的影响
• 2.2.6.6 菌株对PNP 的降解
• 2.2.6.7 菌株对其他有机磷类农药降解性研究
• 2.2.7 菌株质粒的提取
• 2.2.7.1 碱裂解法
• 2.2.7.2 改良TENS 法提取质粒
• 2.2.7.3 质粒快速提取法
• 2.2.7.4 碱法大量提取质粒DNA
• 2.2.8 菌株质粒的消除
• 2.2.8.1 紫外线法
• 2.2.8.2 电穿孔法
• 2.2.8.3 变温SDS 法
• 2.2.9 mpd 基因的克隆
• 2.2.9.1 PCR 扩增目的片断
• 2.2.9.2 DNA 片断与质粒载体的体外重组
• 2.2.9.3 表达载体pRL439-mpd 的构建
• 2.2.10 降解酶的初步研究
• 2.2.10.1 SDS-PAGE 分析
• 2.2.11 四株野生型菌株MPD 水解酶的定位
• 2.2.12 工程菌的酶活分析
• 3 结果与分析
• 3.1 甲基对硫磷菌株的分离鉴定
• 3.1.1 菌株的分离鉴定
• 3.1.2 生理生化特征
• 3.1.3 四株菌16SrDNA 序列分析
• 3.1.4 四株菌16SrDNA 同源性分析及系统发育分析
• 3.2 降解菌对有机磷农药的降解性能测定
• 3.2.1 气相色谱检测结果
• 3.2.2 四株菌对甲基对硫磷的降解曲线
• 3.2.3 菌株接种量对降解性能的影响
• 3.2.4 pH 值对菌株降解性能的影响
• 3.2.5 温度对菌株降解性能的影响
• 3.2.6 四株菌对PNP 的降解
• 3.2.7 菌株对其他有机磷类农药降解性研究
• 3.3 四株野生型菌株质粒的提取
• 3.4 mpd 基因的克隆
• 3.5 工程菌的构建
• 3.6 水解酶的初步研究
• 3.6.1 四株野生型菌株MPD 水解酶的研究
• 3.6.2 四株野生型菌株MPD 水解酶的定位
• 3.6.3 工程菌酶活测定
• 4 讨论
• 4.1 野生型菌株与工程菌株
• 4.2 四株菌降解MP 的途径分析
• 4.3 降解酶系的可诱导性
• 4.4 降解基因的定位与克隆
• 4.5 下一步工作设想
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 在研究生期间发表论文