在线衍生高效液相色谱荧光检测法测定血清犬尿氨酸和色氨酸及其临床应用

论文摘要

目的:1.建立一种简单、快速的在线衍生高效液相色谱荧光法（HPLC—FLD）测定血清中的犬尿氨酸（KYN）。2.建立同时检测血清KYN和TRP的在线线衍生高效液相色谱荧光法。3.初步探讨测定血清KYN和TRP含量变化在类风湿性关节炎中的临床意义。方法:1.血清标本与等量5%（V/V）高氯酸溶液混合处理去除蛋白后离心取上清液20μl直接进样分析。用HpersilC8色谱柱（300mm×6.0mm i.d.,10μm）分离;流动相为0.25 mol/L醋酸锌及50 mmol/L醋酸溶液（含3%乙腈）,流速为1.5ml/min;荧光检测激发波长和发射波长分别为365nm和480nm。KYN经流动相中的醋酸锌在线荧光衍生后,用HPLC-FLD进行测定。KYN峰采用峰保留值比较法和叠加法定性分析,用外标法测峰面积进行定量分析。同时探讨了检测波长、流动相种类、流动相中有机相的比例等因素对分离度和灵敏度的影响,考察了其它5种物质对待测组分的可能干扰。2.在第一部分建立的方法的基础上,调整检测激发波长和发射波长,0-10 min荧光检测激发波长和发射波长分别为,365nm和480nm,10 min后激发波长和发射波长分别为254nm和404nm,实现KYN和TRP的同时测定,并对该方法进行方法学评价。3.测定类风湿性关节炎（RA）患者（n=110例）血清KYN和TRP、初步探讨其含量变化在鉴别诊断、治疗监测、机制研究等方面的临床意义。分析血清KYN、TRP以及KYN/TRP比值与疾病活动性分组、关节X线分期、关节功能分级、类风湿因子（RF）、C反应蛋白（CRP）、血沉的相关性。结果:1.血清标本内的KYN保留时间分别为8.1分钟。KYN线性范围为0.098～19.6μmol/L,最低检测浓度为0.04μmol/L;回收率为90.8-96.2%,日内CV为3.82%,日间为4.63%。苯丙氨酸（PHE）、酪氨酸（TYR）、犬尿喹啉酸（KYNA）、5-羟色胺（5-HT）和肌酐（Cr）在本文的色谱条件下对KYN的测定均无干扰。2.血清标本的KYN和TRP均分离良好,保留时间分别为8.1和11.5分钟。TRP的线性范围为4.9～196μmol/L。最低检测限为0.005μmol/L,回收率为92.6～106.9%,日内CV为3.63%,日间为4.44%。上述5种物质对待测组分KYN和TRP的测定均无干扰3.与正常对照组相比,RA组患者血清KYN含量显著升高、TRP含量显著降低;KYN/TRP比值与RF疾病活动度呈正相关。结论:1.本文建立了在线衍生HPLC-FLD法测定血清KYN,方法简单、快速、灵敏、特异、准确,适宜于临床与科研工作。2.在第一部分的基础上进行改进建立了在线衍生高效液相色谱—荧光检测法能同时测定KYN和TRP,且该方法的精密度,准确性,回收率,抗干扰能力,线性范围等指标均符合诊断实验的要求,具有进样量少、快速、灵敏度高、准确度较高、特异性好的特点。3.RA患者体内存在为严重的犬尿氨酸代谢紊乱,且KYN和KYN/TRP与RA疾病活动度相关,KYN/TRP是RA的疾病活动度指标。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部 前言
• 第二部分 在线衍生高效液相色谱荧光检测法测定血清犬尿氨酸方法的建立及评价
• 第一章 引言
• 第二章 材料与方法
• 第三章 结果与讨论
• 第三部分 在线衍生高效液相色谱荧光法同时检测血清犬尿氨酸和色氨酸方法的建立及评价
• 第一章 引言
• 第二章 材料与方法
• 第三章 结果
• 第四章 讨论
• 第四部分 HPLC-FLD同时检测RA病人血清犬尿氨酸和色氨酸
• 第一章 引言
• 第二章 材料与方法
• 第三章 结果
• 第四章 讨论
• 第五部分 结论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间主要研究成果