miR-1236对肝癌细胞生长的影响及其靶基因的确定

论文摘要

目的:肝癌是仅次于胃癌和食道癌的恶性肿瘤,其发病具有隐匿性、死亡率高的特点,其发生和发展是多基因参与、多步骤完成的复杂过程。miRNA（microRNA）是非编码小分子RNA,可通过调控癌基因、抑癌基因或其他方式调控肿瘤的发生、发展和转归过程。甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）是诊断原发性肝癌的特异性肿瘤标志物,具有早期诊断、鉴别诊断及确立诊断的作用。近年来研究发现AFP是一种与肝癌细胞生长密切相关的内源性蛋白。本实验室的前期工作表明AFP静默导致的生长抑制作用并不主要由于发生了细胞凋亡,而是细胞周期发生G1/S期转变停滞的结果。此研究的目的是为了证实是否存在miRNA调控AFP基因的表达,进而参与了肝癌细胞生长的调控过程。方法:为了研究miRNA在肝癌发生、发展中的影响,我们以AFP作为靶基因通过生物信息学方法预测出了与其3’UTR（3’untranslated region）区互补的miR-1236为研究对象,并且对其在肝癌细胞内的作用进行了深入的研究。首先,我们构建了带有AFP的3’UTR miR-1236靶位点的荧光报告载体,在肝癌细胞系中检测miR-1236对含有AFP3’UTR的荧光报告载体表达水平的影响,来验证AFP是否为miR-1236的靶基因。此后,又通过Real-time PCR和Western blot方法检测了 miR-1236对AFP的mRNA和蛋白水平的影响。在接下来的细胞生长功能实验中,用MTT、平板克隆形成实验检测了过表达及封闭miR-1236后对细胞活性及增殖能力的影响。在确认miR-1236与肝癌细胞生长表型相关之后,构建的质粒pcDNA3/AFP通过对细胞表型的挽救实验,进一步验证AFP是否为miR-1236的靶基因结果:荧光报告载体实验表明miR-1236能够抑制带有AFP靶位点的报告基因的表达。Real-time PCR 和 Western blot 的结果表明 miR-1236 能够影响 AFP 的 mRNA和蛋白水平。细胞生长功能实验的结果表明,过表达miR-1236能抑制肝癌细胞活性和增殖能力,封闭掉miR1236能增强肝癌细胞活性和增殖能力。外源性的增加细胞内AFP的水平,可以有效的挽救由过表达miR-1236引起的细胞生长表型的变化。结论:miR-1236是抑制肝癌细胞生长的重要miRNA,其发挥调节作用是通过调节AFP表达来实现的。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 符号说明
• 前言
• 研究现状
• 研究目的、方法
• 一、肝癌细胞系中靶定AFP的miRNA的确定及其功能分析
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 实验材料
• 1.1.2 方法
• 1.2 结果
• 1.2.1 靶定AFP的miRNA的预测
• 1.2.2 pcDNA3/pri-mir-1236质粒的构建
• 1.2.3 瞬转pri-miR-1236和ASO-1236后Real-time PCR检测质粒有效性
• 1.2.4 EGFP报告系统验证在肝癌细胞中AFP是miR-1236的靶基因
• 1.2.5 miR-1236对HepG2细胞AFP蛋白水平的影响
• 1.2.6 Real-time PCR检测HepG2细胞中miR-1236对AFP mRNA水平的影响
• 1.2.7 Real-time PCR检测肝癌组织中AFPmRNA以及miR-1236的表达水平
• 1.3 讨论
• 1.3.1 靶定AFP的miRNA的证实
• 1.3.2 miR-1236对AFP表达的负性调节作用
• 1.4 小结
• 二、miR-1236对肝癌细胞系HepG2、QGY-7703细胞生长的影响
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 MTT检测分析miR-1236对肝癌细胞活性的影响
• 2.2.2 平板克隆形成实验
• 2.2.3 Western bolt检测pcDNA3/AFP质粒有效性
• 2.2.4 在QGY-7703细胞中过表达AFP蛋白对细胞生长表型的影响
• 2.2.5 挽救实验
• 2.3 讨论
• 2.3.1 miR-1236对肝癌细胞的表型影响
• 2.3.2 挽救实验
• 2.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 综述 MiRNA与肝细胞癌的诊断和预后
• 综述参考文献
• 致谢